Протокол генерации гнотобиотических тараканов облегчает тестирование влияния удаления и замены нативного кишечного микробного сообщества на здоровье хозяина и сборку микробиома. Этот метод использует методы из нескольких источников для формирования сплоченного, оптимизированного рабочего процесса для генерации гнотобиотических тараканов без использования дорогостоящего специализированного лабораторного оборудования. Учитывая множество различных движущихся частей этого гнотобиотического протокола, визуализация помогает исследователям легче создавать свои собственные небольшие, недорогие, настольные гнотобиотические установки.
Чтобы облегчить сбор соответствующего количества самок, несущих оотеки для запланированных экспериментов, используйте щипцы для перемещения картонных трубок, содержащих гравидных самок, в резервуаре для запасов. Если картонная трубка содержит несколько насекомых в дополнение к самке гравида, встряхните содержимое трубки в дополнительный пластиковый контейнер, окольцованный вазелином, и предложите целевому насекомому забраться обратно в картонную трубку в одиночку. После сбора перенесите каждую гравидную самку в родильное отделение.
Как только самки сбросят свои оотеки, верните самок в резервуар для запаса и используйте щипцы, чтобы извлечь оотеки из помета. Чтобы очистить оотеки, поместите до пяти ящиков для яиц в пятимиллилитровую центрифужную трубку, содержащую три миллилитра додецилсульфата натрия, и вихрь оотеки в течение 10 секунд. После второй стирки, как только что было продемонстрировано, используйте деликатную салфетку, чтобы аккуратно очистить поверхность каждой оотеки, чтобы удалить любой мусор и поместить очищенную оотеку в весовую лодку.
Перед стерилизацией заполните две 1,5-миллилитровые центрифужные трубки на оотеку одним миллилитром стерильной воды на трубку. Также добавьте 10 микролитров 32%-го раствора перуксусной кислоты к 3,2 миллилитрам двойной дистиллированной воды в пятимиллилитровой центрифужной трубке в вытяжном вытяжке. Колпачок и инвертирование несколько раз перемешать и поместить до пяти очищенных оотек в свежеприготовленный 0,1% раствор перуксусной кислоты в течение пяти минут, переворачивая трубку несколько раз каждые 60 секунд.
Перуксусная кислота является сильным окислителем для глаз, кожи и дыхательных путей, а также легковоспламеняющимся и коррозионным. Всегда носите надлежащие СИЗ во время обработки и утилизируйте ваши отходы соответствующим образом. В конце инкубации используйте стерильные щипцы и ламинарной проточной вытяжке, чтобы перенести каждую оотеку в собственную центрифужную трубку со стерильной промывной водой.
Перевернуть несколько раз, чтобы перемешать перед переносом оотеков во второй набор трубок промывной воды. После второго полоскать используйте стерильные щипцы для переноса оотеков на отдельные наклоны BHI. Поместите сланцевые носы в стерилизованный вторичный контейнер и переместите контейнер в увлажненный инкубатор с 30 градусами Цельсия в течение четырех-пяти недель, пока он не вылупится.
Регулярно проверяйте сланцы один-два раза в неделю на грибковый или бактериальный рост до четвертой недели, после чего сланцы должны проверяться ежедневно. Когда нимфы начнут вылупляться, используйте стерильные щипцы и ламинарной проточной капюшон, чтобы асептически перенести гранулу стерилизированного крысиного чау в подготовленную колбу BHI. В качестве проверки стерильности поместите колбу во вторичный контейнер в инкубатор с 30 градусами Цельсия на 24 часа, чтобы подтвердить отсутствие загрязняющего роста.
Если колба осталась стерильной, вытряхните нимф из наклона, позволив им упасть в колбу в ламинарной вытяжке. Затем поливайте нимф 300 микролитрами стерильной воды один раз в неделю в ламинарной вытяжке. Когда фекалии нимф начнут покрывать средний пол, перенесите нимф в новую колбу BHI, содержащую стерилизованный крысиный чау, добавленный за 24 часа, как показано.
Беременные самки могут быть идентифицированы по оотеке, прикрепленной к их задним брюшкам. Оотеки вылупляются в среднем через 34 дня после стерилизации. В случаях неудачной стерилизации рост может появиться вокруг оотеков во время инкубации, что ставит под угрозу гнотобиотический статус детенышей.
Затем скорость роста нимфы можно отследить, измерив длину тела насекомого. Полиморфизм длины рестрикации фрагмента рибосомной ДНК 16S гомогенизированной нимфы может быть использован для подтверждения гнотобиотического статуса. Гнотобиотические тараканы могут быть привиты синтетическими или ксенобиотическими микробными сообществами.
Хотя этот конкретный рабочий процесс является новым, предыдущие исследования с использованием гнотобиотических тараканов дали представление о сборке кишечного микробиома и микробной роли в формировании социального поведения, здоровья кишечника и иммунитета их насекомых-хозяев.
