Этот протокол может быть использован для применения внеклеточного анализатора потока для мониторинга изменений энергетического метаболизма во время емкости спермы. Мы разработали этот протокол для сравнения изменений в гликолизе и окислительном фосфорилировании в режиме реального времени между недееспособной и недееспособной спермой мыши. За день до анализа снимите сенсорный картридж с комплекта анализа внеклеточного потока и поместите картридж вверх дном рядом с коммунальной пластиной.
Заполните резервуар раствора 25 миллилитров двойной дистиллированной воды и добавьте 200 микролитров воды к каждому колодец полезной пластины, а затем поместите картридж датчика обратно в утилиту пластины. Поместите пластину в инкубатор неуглеродного диоксида по Цельсию на 37 градусов Цельсия. Далее, aliquot 25 миллилитров внеклеточного потока анализатора калибранта в 50 миллилитров конической трубки и поместите трубку в 37 градусов по Цельсию неуглеродного диоксида инкубатора.
Для подготовки ConA покрытием микро пластин, растворить 2,5 миллиграмма ConA в пяти миллилитров двойной дистиллированной воды и использовать многоканальный пипетку, чтобы заполнить каждый колодец внеклеточного потока анализатор 96-ну пластины с 50 микролитров раствора ConA, а затем оставить крышку открытой, чтобы пластина высохнуть на ночь. Чтобы подготовить буфер спермы, нагрейте 250 миллилитров внеклеточного анализатора потока TYH буфера до 37 градусов по Цельсию и отрегулируйте рН до 7,4. В день анализа замените воду в каждом колодеце коммунальной пластины 200 микролитров калибранта XF на колодец и поместите пластину обратно в инкубатор неуглеродного диоксида, по крайней мере, на один час.
Чтобы создать шаблон волны, включите внеклеточный анализатор потока. В то время как температура стабилизируется до 37 градусов по Цельсию, откройте программное обеспечение волны и откройте пустой шаблон. В соответствии с группой определений вкладке, определить анализ среды, как TYH и типа клеток, как мышь спермы, в результате чего инъекционные стратегии и предварительной обработки пустым.
Создайте различные группы для каждого состояния анализа и откройте карту плиты, чтобы назначить каждую группу к определенным скважинам. В соответствии с вкладкой протокола, unhighlight equilibrate, добавить каждый из четырех различных циклов измерения, выбрать соответствующий порт, и редактировать детали измерения так, что мера после инъекции выделена, а затем сохранить шаблон анализа, заполнить резюме проекта и сохранить результаты. Перед сбором спермы, довоенная 50 миллилитров буфера TYH при 37 градусах по Цельсию.
После сбора кауд от взрослых мышей мужского пола, поместите каждую кауду в 500 микролитров предварительно разогретого буфера TYH в отдельных колодцах 24-хорошо пластины. Используйте типсы, чтобы обездвижить каждую кауду индивидуально в нижней части каждого хорошо и быстро сделать пять-семь небольших разрезов в каждой ткани с помощью перьевых ножниц. Когда все caudas были incised, немедленно поместите пластину в неуглеродный инкубатор диоксида, чтобы позволить сперме разойтись в течение 15 минут.
Чтобы загрузить сенсорный картридж, снимите крышку с сенсорного картриджа и выровняйте букву соответствующего руководства по погрузке порта с верхним левым углом картриджа. Удерживая руководство по погрузке порта на месте, вставьте наконечники пипетки вертикально в отверстия для загрузки порта А и ввелите 20 микролитров буфера TYH в каждую колонку. Для порта B, введать 22 микролитров буфера TYH в столбцы от одного до четырех, 22 микролитров 500 миллимолярный 2-deoxyglucose в столбцы от пяти до восьми, и 25 микролитров из пяти микромолечных антимицина ротенон в столбцы с девяти до 12.
Для порта C ввезу 25 микролитров буфера TYH в каждую колонку с нечетными числами и 25 микролитров по 10 миллимоляров дибутирил-циклического микромолара IBMX в каждую колонку с четными числами, затем поместите сенсорный картридж с калибровочной пластиной во внеклеточный анализатор потока и начните анализатор. Калибровка займет от 10 до 15 минут. Чтобы подготовить сперматозоиды, добавьте три миллилитра по три миллиграмма на миллилитр бычьего альбумин сыворотки в буфере TYH к каждой из трех пяти миллилитровых центрифугных трубок.
Далее, бассейн два колодца спермы в каждой из трех 1,5 миллилитров центрифуг трубки. После подсчета, разбавить сперму в два раза от 10 до семи сперматозоидов на миллилитр концентрации на образец в свежем TYH дополняется бычьей сыворотки альбумин. Осадок спермы центрифугации и повторного высасывания гранул спермы в один миллилитр буфера TYH.
Центрифуга спермы снова и удалить supernatants заботы, чтобы не беспокоить гранулы. Перенесите каждую суспензию спермы в одну из подготовленных пяти миллилитров центрифуг и добавьте 180 микролитров буфера TYH в каждый угол хорошо пластины с покрытием ConA. Добавьте 180 микролитров спермы в каждый пустой колодец пластины с покрытием ConA и центрифуга пластины два раза вращая пластину 180 градусов между центрифугациями, затем поместите калибровочную пластину с пластиной спермы и продолжить анализ.
В этом репрезентативном эксперименте сперматозоиды были емкости в присутствии глюкозы в качестве единственного энергетического субстрата и 2-дезиглюкозы и антимицина и ротенона в качестве фармакологических модуляторов. Стрелка указывает на индукцию емкости. При наличии глюкозы, емкость сопровождалась семикратным увеличением внеклеточной скорости подкисления, которая подавляется блокированием гликолиза с 2-дезиглюкозой.
Конденсатная сперма продемонстрировала 20-кратное увеличение скорости потребления кислорода по сравнению с недееспособной спермой, демонстрируя, что сперма мыши усиливает как гликолиз, так и окислительный фосфорилирование для поддержки растущего спроса на энергию во время емкости. На рост уровня внеклеточного подкисления во время емкости спермы не влияют ингибиторы окислительного фосфорилирования антимицин А и ротенон, указывающие на то, что изменение этого уровня в основном обусловлено выбросом водорода из гликолиза. Увеличение скорости потребления кислорода, однако, блокируется антимицином А и ротеноном, а также 2-дезиглиглукозой, показывая, что увеличение ОКСФОС во время емкости спермы зависит от гликолитической активности.
Источник энергии и фармакологические активаторы и ингибиторы могут быть разнообразны в зависимости от цели эксперимента и до 12 различных условий могут быть измерены параллельно. Протокол может быть легко адаптирован к другим видам, таким как человек или бык, где изменения в энергетическом метаболизме во время емкости одинаково загадочны.
