Эти модели могут быть реализованы для оценки различных аспектов заживления ран ответ, в том числе клеточной и цитокиной кинетики и раны закрытия. Модель губки PVA позволяет вызволение миллионов раневых лейкоцитов для фенотипических и функциональных анализов, в то время как модель иссечения кожи хвоста позволяет легко визуализировать медленно заживляющие раны. PVA губки и excisional модели раны хвоста могут быть использованы в сочетании с сопутствующими заболеваниями, такими как диабет или пневмония, чтобы понять их влияние на заживление ран.
Демонстрацией процедур с Мередит Крейн будет Билл Генри, научный сотрудник из моей лаборатории. Перед началом эксперимента используйте ножницы, чтобы разрезать листы губки PVA на кусочки восемь на восемь на четыре миллиметра. Регидратировать кусочки губки в стерильных PBS в стакане в течение 10 минут, прежде чем автоклав стерилизации губки в PBS.
Когда губки остынет, хранить губки погружены в PBS при четырех градусах по Цельсию. В день процедуры поместите шесть губок на экспериментальное животное в стерильное блюдо культуры в стерильный ламинарный капюшон потока, и подтвердите отсутствие реакции на щепотку ноша в анестезированной, от восьми до 12-недельной, мужской, C57-Black/6 мыши. У помощника использовать клиперы, чтобы удалить волосы вдоль спины и стерильной марли, чтобы применить раствор povidone-йода в бритой области в два раза, а затем один 70% этанола применения.
Затем помощник должен перенести мышь на стерильные хирургические шторы, размещенные на подогретой площадке. Ношение стерильных перчаток, использовать типсы, чтобы вытащить спинной кожи от основной ткани, и использовать стерильные хирургические ножницы, чтобы сделать двухсемейный разрез вдоль спинной средней линии примерно два сантиметра передней к основанию хвоста. Держа разрез открытым стерильными типсами, используйте стерильные, изогнутые, тупые хирургические ножницы, чтобы сформировать подкожный карман вдоль спины в одном из положений, как указано на рисунке.
После того, как ножницы были вставлены, откройте и закройте кончики два раза, чтобы сформировать карман достаточно большой, чтобы держать вставленную губку. Когда карман был создан, используйте стерильные хирургические ножницы, чтобы аккуратно сжать одну губку PVA в культуре блюдо, чтобы удалить избыток PBS. Затем поднимите губку на один угол и, ведя с угла, угощенного ножницами, поместите губку в подкожный карман.
Когда все шесть губок были помещены, как показано на фото, используйте стерильные щипцы, чтобы ущипнуть наклонной спинной кожи вместе, и закрыть разрез с двумя зажимами раны из нержавеющей стали. Для изоляции жидкости губки PVA, от одного до 14 дней после имплантации, удалить хирургические скобы, и открыть разрез с зубчатыми типсами. Используйте ножницы, чтобы расширить разрез вдоль спинной средней линии, и использовать типсы, чтобы извлечь одну губку из подкожного кармана.
Поместите губку в бочку пятими миллилитрового шприца, вложенного в 16-миллилитровую культурную трубку на льду, и используйте ножницы, чтобы при необходимости отмежевать любую соединительной ткани, которая остается приверженной поверхности губки. Когда все губки были извлечены и переданы, как показано на фото, центрифуга культуры трубки для сбора раны жидкости. Чтобы изолировать клетки от губок PVA, после сбора губки, как только что продемонстрировали, поместите их в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую пять миллилитров HBSS сбора среды.
Когда все губки были собраны, decant губки подвески в 80-миллилитровый блендер мешок, и повесить мешок из люка весло блендер так, что весла ударит губки и среды. Установите весло блендер для запуска на высоком в течение 60 секунд, и нажмите начать. Когда блендер остановился, сожмите губки в сумке, чтобы полностью освободить среду, и использовать пипетку для передачи среды из блендера мешок обратно в 15-миллилитровую трубку.
Отрегулируйте настройки весла блендер для запуска в течение 30 секунд на высоком, и добавить пять миллилитров среднего блендер мешок. Повторите процесс желудка еще два раза, прежде чем центрифугировать трубку собранной среды. Красные гранулы клеток и красных кровяных телец должны быть видны в нижней части конической трубки.
Смешайте 900 микролитров дистиллированной воды с клетками в течение трех-пяти секунд, прежде чем нейтрализоватьлиз с 100 микролитров 10x PBS и четыре миллилитров 1x PBS. Соберите клетки путем центрифугации, и повторно поместить гранулы белых клеток в соответствующей среде для анализа вниз по течению. Для создания раны хвостовой части кожи, после подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноша в анестезированной, от восьми до 12-недельной, мужской, C57-Black/6 мыши, используйте стерильную марлю, чтобы применить раствор povidone-йода два раза к хирургическому месту, а затем одно применение 70% этанола.
Используя перманентный маркер и готовый шаблон, отследите секцию 10 на три миллиметра на спинной поверхности хвоста, в 10 миллиметрах от хвостовой базы, и поместите мышь на стерильные хирургические шторы. Нося стерильные хирургические перчатки, используйте стерильное лезвие скальпеля, чтобы сделать разрез толщиной вдоль правого, нижнего и левого краев области раны. Используя стерильные типсы, очистить вырезанную кожу от хвоста и использовать стерильные хирургические ножницы, чтобы отрезать верхний край области раны.
Используйте стерильную марлю, чтобы оказать давление на рану, чтобы остановить кровотечение, и применить спрей барьерную пленку на раневую кровать. Затем сфотографируйте раны с фиксированного расстояния через регулярные промежутки времени и проанализируйте фотографии с помощью планиметрического анализа для определения измерений области раны. Операция по имплантации губки PVA генерирует системную воспалительную реакцию, о чем свидетельствует индукция ИЛ-6 в плазме через день после ранения.
Количество клеток, которые могут быть извлечены из ран губки PVA увеличивается с течением времени, с нейтрофилов, моноцитов и макрофагов, включающих первичных клеточных проникновения популяций в губках. Нейтрофилов определены как Ly6G-положительные, Siglec-F-отрицательные клетки. Siglec-F-положительные клетки в первую очередь эозинофилов.
Gating на Ly6G-отрицательных, Siglec-F-отрицательных клеток позволяет идентифицировать F4/80-положительных моноцитов и макрофагов. F4/80-положительные клетки могут быть дополнительно дифференцированы по их экспрессии Ly6C, чтобы различать Ly6C высоких воспалительных моноцитов и Ly6C низких моноцитов полученных макрофагов. Эксцисиональная модель кожи хвоста обеспечивает альтернативу методу биопсии спинной кожи для изучения закрытия раны в твердой коже, лишенной плотного меха.
Замыкание раны можно количественно измерить путем измерять зону кровати раны над временем. Рана хвостовой части кожи также может наблюдаться в поперечном сечении гистологическим анализом с помощью Окрашивания H и E и Masson's. На этих снимках боковой наценки вырезанной кожи обозначены наконечниками стрел на спинной поверхности хвоста.
Чтобы понять устойчивое заживление раны, терапевтические соединения или вмешательства также могут быть проверены через их инъекции непосредственно в губку PVA или через доставку в хвост раны кровать.
