Высвобождение внеклеточных ловушек нейтрофилами и другими иммунными клетками имеет важное значение для врожденного иммунитета, но также тесно связано с воспалительными патологиями. Очень мало известно об этом процессе в макрофагах, хотя эти клетки играют важную роль в воспалительной реакции. Этот протокол обеспечивает первичную человеческую модель экстракорпорального высвобождения макрофагов внеклеточной ловушки или мачты.
Она дает нам модель для изучения потенциального физиологического роста этой структуры in vivo. Основным преимуществом этого метода является то, что клетки из этого протокола являются первичными клетками, изолированными от препаратов человеческого баффи пальто. Существует не грунтовки шаг, необходимый для дифференцировать моноцитов в макрофаги, который контрастирует с другими моноцитов клеточной линии, такие как THP-1 клеточной линии.
Этот протокол легко адаптируется к другим иммунным клеткам, включая изолированные нейтрофил и микроглии. Внеклеточная ловушка, производимая макрофагами, очень хрупка, поэтому необходимо принимать меры между шагами, чтобы сохранить целостность окрашенных ловушек. В стерильных условиях подготовьте среду грунтовки M1, добавив к полной культуре RPMI-1640 средства массовой информации, интерферон гамма к концентрации 20 нанограмм на миллилитр и липополисахарид к концентрации одного микрограмма на миллилитр.
Подготовь средства массовой информации M2, добавив интерлейкин 4 к полной культуре RPMI-1640 к концентрации 20 нанограмм на миллилитр. В стерильных условиях, аспирировать средства массовой информации из семян и культурных тканей культуры пластины скважин, содержащих HMDM. Аккуратно добавьте в каждый колодец один миллилитр стерильного PBS, предварительно разогретый до 37 градусов по Цельсию.
Удалите буфер PBS и промойте еще два раза. Добавьте один миллилитр либо M1 или M2 грунтовки средств массовой информации для каждого хорошо содержащие HMDM. Инкубировать клетки в течение 48 часов при 37 градусах по Цельсию в присутствии 5%-ного углекислого газа в клеточном инкубаторе.
В стерильных условиях подготовь культурные средства массовой информации, содержащие различные стимуляторы ВЫПУСКА MET, к полным средствам RPMI-1640. Для экспериментов со стимуляцией гипохлорной кислоты приготовьте 200 микромолярной гипохлорной кислоты в трубке Falcon с HBSS, предварительно разогретой до 37 градусов по Цельсию. После лечения поляризации, аспирировать клеточные средства массовой информации из каждого хорошо и тщательно мыть клетки три раза с одним миллилитр aliquots либо стерильных PBS для PMA, TNF альфа, и интерлеукин 8 стимуляции или HBSS для гипохлорной стимуляции кислоты.
После удаления PBS в заключительном этапе стирки, добавить один миллилитр полных средств массовой информации, содержащих PMA, TNF альфа, или интерлейкин 8. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в клеточном инкубаторе в течение шести часов для стимуляции альфа TNF и 24 часов для стимуляции PMA или интерлейкина 8. Для экспериментов с гипохлорной кислотой, после удаления HBSS в заключительном этапе стирки, добавьте один миллилитр свежеприготовленной гипохлорной кислоты.
Затем инкубировать клетки в течение 15 минут при 37 градусах по Цельсию в присутствии 5%углекислого газа в клеточном инкубаторе. После этого тщательно аспирировать клетки'supernatant и мыть клетки три раза с одним миллилитр aliquots HBSS. После удаления HBSS от заключительного шага мытья, добавить один миллилитр полного RPMI-1640 культуры средств массовой информации.
Затем инкубировать клетки в течение 24 часов при 37 градусах по Цельсию в присутствии 5%углекислого газа в клеточном инкубаторе. Приготовьте зеленый краситель SYTOX в HBSS с концентрацией 40 микромолей. Непосредственно добавьте 25 микролитров красителя к каждому хорошо содержащем HMDM.
Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 5 минут в темноте. Затем поместите HMDM в скважины культуры тканей на стадии микроскопа перевернутого флуоресцентного микроскопа для визуализации. Включите флуоресцентный источник света широкого спектра действия, источник ярко-полевого света и перевернутый микроскоп, установленный цифровой камерой высокого разрешения.
Поверните колесо фильтра на положение номер два для зеленой флуоресценции с возбуждением на 504 нанометров и размером на 523 нанометров. Используя цель 5X, сосредоточьте изображение с грубым фокусом, а затем тонкой ручки фокусировки на микроскоп, пока изображение не появится резким, ясным и целенаправленным. Переключитесь микроскоп в режим камеры.
Запустите связанное программное обеспечение. Нажмите кнопку Воспроизведение, чтобы просмотреть изображение и настроить тонкую ручку фокусировки на микроскоп, пока изображение не появится резким, ясным и сфокусированным в окне предварительного просмотра программного обеспечения. Нажмите кнопку Захвата.
В программном обеспечении нажмите Файл. Сохранить как необходимый тип файла изображения. На микроскопе поверните колесо фильтра на положение номер пять для изображения яркого поля и повторите процедуры захвата, чтобы получить соответствующее ярко-полевое изображение.
Яркие полевые изображения, показывающие морфологические изменения HMDM в ответ на раздражители показаны здесь. M1-поляризованные макрофаги из экспериментов с HMDM подвергаются интерферон гамма и липополисахарид показал удлиненные и шпиндель-как форма клеток. Для сравнения, морфология М2-поляризованных макрофагов после воздействия HMDM на интерлеукин 4 в течение 48 часов, как правило, круглые и плоские.
Способность дифференцированных фенотипов HMDM выпускать METs была визуализирована живоклеточной флуоресценцией с SYTOX зеленым цветом. Контроль, полученный от каждого фенотипа HMDM, инкубированного в течение 24 часов при отсутствии каких-либо провоспалительных стимулов, показал очень ограниченное зеленое окрашивание. Положительное окрашивание для METs, показано как зеленые полосы, было достигнуто с воздействием M1-HMDMs к гипохлорной кислоты, PMA, интерлейкин 8, или TNF альфа.
Присутствие некоторых зеленых окрашивания очевидно в клетках отражает потерю целостности мембраны, которые могут возникнуть в результате смерти клеток, которая не зависит от внеклеточной ловушки релиз. Эксперименты, проведенные с M2-HMDMs подвергаются интерлейкин 4 показали отсутствие высвобождения ДНК из клеток, о чем свидетельствует отсутствие нитей или полос внеклеточной ДНК. Тем не менее, было некоторое клеточное поглощение зеленого флуоресцентного красителя с гипохлорной кислотой и альфа TNF.
Важно избегать прямого яркого света, который может переэкспонировать окрашивание перед визуализацией. Внеклеточная ДНК может быть количественно с помощью qPCR-анализа ядерной и митохондриальной ДНК, присутствуют в клеточном супернатанте. Дальнейшая характеристика структуры мачты и ее роли в хроническом воспалении с использованием HMDM может быть более клинически актуальной по сравнению с другими увековеченными магазинами макрофагов клеточной линии.
