Кластеризация рецепторов повсеместна и часто необходима для сигнализации каскадной активации. Однако для измерения степени кластеризации имеется мало методов. Мы используем полную внутреннюю флуоресценцию отражения, микроскопию TIRF, чтобы следить за диффузией молекул FGFR1-mEGFP в плазменной мембране живых клеток.
Затем мы применяем яркость числа, анализ N и B, чтобы описать динамику кластеризации стимулирующих рецепторов. TIRF идеально подходит для быстрой височной визуализации молекулярных событий, происходящих вблизи поверхности клетки, в то время как N и B определяет среднее олигомерное состояние флуоресцентных молекул на основе того, где диффузия в и из объема освещения микроскопа. Действительно, это инструмент для подключения пространственной временной организации рецепторов на поверхности клетки, где они сигнализируют.
N и B нужен только доступ к микроскопу с модулем быстрого приобретения. Вы можете проанализировать большую площадь живых клеток, имеющих только базовые знания методов флуктуации флуоресценции. Этот метод может быть применен к белкам, которые образуют димеры или кластеры и могут быть стоихиометрически помечены флуоресцентным красителем.
Если белки находятся во внутриклеточных отсеках, другие типы микроскопов используются для приобретения изображений. Важно подготовить конструкцию, которая выражает мономерную форму флюорофора для измерения в экспериментальных условиях чистой мономерной яркости в качестве контроля. В первый день семенные клетки HeLa в 1,5 миллилитров полной среды в концентрации от 100 000 до 200 000 клеток на миллилитр в стеклянно-нижней посуде.
Семена от шести до восьми реплицируют блюда и инкубируют в инкубаторе при 37 градусах цельсия. На второй или третий день клетки достигли субвлияния. Добавьте безотхвкую среду с белковой плазмидой в половину блюд и добавьте эталонные плазмиды с мономером и димером во вторую половину блюд, чтобы пролифицить клетки.
Через день проверьте, что трансфицированные клетки придерживаются дна посуды и клеточная мембрана флуоресцентная. Откажитесь от блюд с заросшими клетками или с очень низкой флуоресценцией. За четыре часа до начала эксперимента активируйте температурный инкубатор микроскопа при температуре 37 градусов по Цельсию.
Включите микроскоп, компьютеры и камеры, и ждать камеры, чтобы достичь надлежащей рабочей температуры минус 75 градусов по Цельсию. Поместите небольшую каплю масла на объектив цели. Положите образец блюда в инкубатор микроскопа, и закрыть двери инкубатора, чтобы температура блюда равновесной в течение 10 минут.
Включите лампу эпифлуоресценции и 488-нанометровый лазер. Выберите режим контрастности эпифлюоресценции, чтобы исследовать образец, ища клетку, чтобы сосредоточиться на глазной линзе. Выберите правильный фильтр для сбора зеленого излучения через микроскоп камеры с bandpass Ex 490/20 500 и bandpass Em 525/50 или аналогичный.
Переключитесь с глазного на кулачок в режиме эпифлуоресценции. Уточните фокус и измените режим TIRF. Затем активируйте автоматическое выравнивание в соответствии с инструкциями микроскопа TIRF.
Выберите подходящую глубину освещения и оптимизируйте направление эвакуационные поля. Переключитесь на вторую камеру. Определите область, интересную не менее 256 на 256 пикселей.
Установите воздействие на одну миллисекунду, а EM получить до 1000. Отрегулируйте мощность лазера до 0,5 милливатт. Необходимо иметь некоторую информацию о коэффициенте диффузии белка, потому что время экспозиции должно быть короче, чем среднее время, проведенное флуоресцентными молекулами в освещенном объеме.
Запустите первую пробную последовательность при первоначальных условиях и приблизительно оцените значение сигнала к шуму. Условия приемлемы при сигнале к шуму, равном двум-трем или выше, как это измеряется в первой серии времени. Затем используйте ползунок системы расщепления выбросов, соединяющей камеру номер два с микроскопом для маскировки стороны изображения.
Выберите опцию автоматического сохранения файла камеры. Начните приобретение серии изображений как минимум за 700 кадров при минимальном соотношении сигнала к шуму в два. Не вынюхив блюдо из микроскопа, добавьте лиганд.
Выберите ячейку с яркой флуоресцентной мембраной и быстро запустите первую серию кинетических запусков. Поиск второй ячейки, и приобрести вторую точку времени кинетики. Захват новой ячейки для каждой точки времени кинетического запуска.
Для каждого нового блюда повторите выравнивание лазерной линии и оптимизацию освещения TIRF. Теперь конвертировать и сохранить файлы изображений, приобретенные с помощью программного обеспечения камеры в качестве тиф-файлов. Импорт tif файлов в анализ программного обеспечения рутины путем активации N и B графических пользователей интерфазы MATLAB.
Отбросить серию, для которой средний профиль интенсивности показывает более 10%photobleaching и серии, в которых наблюдается очевидное искажение клеточной мембраны или перевод во время приобретения. Урожай кадры, которые, очевидно, не в фокусе. Держите для анализа только серии, по крайней мере 500 таймфреймов.
Сначала определите параметры камеры. Активируйте обычную калибровочную камеру. Выберите область размером не менее 20 на 50 пикселей в области шума детектора.
В частоте журнала по сравнению с цифровым сюжетом уровня перемести линейный красный курсор, чтобы разграничить гауссийский язык в линейной части кривой. Активируйте клавишу B. Применить минимальное binning 2.2 для уменьшения дисперсии данных и для создания Гистограммы B-I.
Используйте итеративный квадратный курсор для проверки гистограммы B-I. Выберите квадратную рентабельность инвестиций для анализа и создать B-карту выбранной рентабельности инвестиций. Затем сохраните файл ASCII B-значений, связанных с выбором.
Импорт ASCII в графическом программном обеспечении для вычисления частотного распределения данных и получения среднего B-значения плюс или минус S.E.Apply уравнение эпсилон для получения средней яркости для каждой ячейки в каждый момент кинетического запуска. Нормализация данных в соответствии с уравнением нормализации, где B't является средним B-значением, измеренным во время t после добавления лиганда и B'0, является средним B-значением, измеренным в то время, когда t равен нулю, что составляет от 10 до 20 секунд после лигандового аддитино. Участок нормализованной средней яркости по сравнению с приобретением времени для создания кинетического запуска.
В этом исследовании показаны репрезентативные результаты двух клеток HeLa в одном и том же блюде, выражаюющих mEGFP-FGR1, захваченных во время нуля и семи, после добавления 20 нанограмм на миллилитр FGF2. По сравнению с эталонные конструкции, GPI-mEGFP и GPI-mEGFP-mEGFP dimer, вся последовательность анализа показывает среднюю интенсивность тайм-ряда. Участок всех B-значений.
Гистограмма B-I. B-карта выбранной рентабельности инвестиций. И связанная с этим Гистограмма B-распределения.
После стимуляции с 20 нанограмм на миллилитр FGF2, репрезентативные кинетические трассы, показывающие среднюю яркость как функцию времени, описывают медленный процесс димеризации, который сохраняется в течение нескольких минут на поверхности клетки. При стимуляции с 50 микрограмм на миллилитр NCAM-Fc, кинетический профиль показывает быстрые и циклические переходы рецептора в олигомерных смесей, который также достигает значения яркости выше, чем у димера. Неоднократно наблюдалось нормализованное среднее значение в три.
Важно минимизировать дополнительные варианты из-за отсутствие молекулярных колебаний и отбеливания. А клетки должны быть хорошо привязаны к стеклянно-нижней тарелке, не заросшие и не скапливаемые. Если мы заинтересованы в белке, который быстрее рассеивается внутри внутриклеточных отсеков, мы можем применять более быстрые нулевые времена и использовать сканирование на фокусных или мультифотонных микроскопах для изображения внутри клетки.
С помощью нашего подхода мы минимизируем пагубные последствия фотоотверга, когда хотим изучить динамику таких событий, как димеризация. Эти события контролируют различные клеточные реакции и очень трудно доказать в живых клетках с другими методами.
