Низкая эффективность трансфекции является основным препятствием для определения того, как белок активирует neurite рост в первичных нейронов. Наш протокол преодолеть эту проблему путем совместной трансфекции EGFP для выявления успешно трансфицированных клеток. Высокий уровень совместной трансфекции EGFP и белков, представляющих интерес обеспечивает точность анализа.
И, следовательно, иммунофлуоресценции окрашивания в настоящее время требуется. Как neurite рост происходит во время нервной регенерации, этот метод может быть применен к выявлению новых целей для восстановления поврежденной нейронной сети в черепно-мозговой травмы или нейродегенеративных заболеваний. Перед началом процедуры поместите стерильные 18-миллиметровые круговые крышки в каждый колодец из 12 хорошо ткани культуры пластины и пальто каждый coverslip с пятью микрограммами на миллиметр Раствора Poly-D-Lysine во влажной 37 градусов по Цельсию инкубатор, по крайней мере один час.
В конце инкубации аспирировать раствор Poly-D-Lysine и промыть крышки стерильной водой. На эмбриональный день 18, место матки собраны из время беременности Sprague Доули крысы в 10 сантиметров Петри блюдо и использовать небольшие рассечения ножницы, чтобы открыть матку и амниотический мешок. Используйте ножницы, чтобы удалить плаценту и использовать типсы для передачи одного целого эмбриона в новую 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую охлажденную глюкозу PBS.
Используйте ножницы, чтобы сократить вдоль sagittal шва черепа и использовать небольшой плоский шпатель для передачи эмбрионального мозга в новый 10 сантиметров Петри блюдо, содержащее свежий ледяной глюкозы PBS. Используя два пинцета номер пять и микроскоп вскрытия, отделить два полушария головного мозга от мозжечка и ствола мозга и удалить оболынивания. Затем изолируйте кору из полушарий головного мозга и поместите кору в 15 миллилитровую трубку, содержащую свежую ледяную глюкозу PBS.
Для первичной культуры корковых нейронов, в классе II биобезопасности кабинета, позволяют коры осесть под действием силы тяжести в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию, прежде чем заменить глюкозу PBS с 0,05%трипсина ЭДТА. Смешайте с нежным постукиванием и инкубировать ткани в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 10 минут с дополнительным нежным постукиванием каждые две минуты. В конце инкубации, остановить пищеварение с четырьмя миллилитров поддержания среды и использовать один миллилитр пипетки для разобщения ткани с нежной тритурации.
Осадок клеток центрифугации и повторно гранулы в один миллилитр среды обслуживания для второй центрифугации. Resuspend гранулы, образоваваемые после второй центрифугации в один миллилитр свежей среды обслуживания для подсчета и пластины изолированных нейронов в 6,5 раза от 10 до четвертого жизнеспособных клеток на сантиметр квадратной концентрации в один миллилитр поддержания среднего на колодец в 12 хорошо пластины. Через два дня при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе разбавляйте EGFP и целевую белковую плазмиду ДНК и трансфектический реагент в двух отдельных 1,5 миллилитровых трубках, а затем смешивайте их вместе.
Transfect клетки с EGFP построить путем добавления трансфекции смесь скважин. После 24 часов, мыть клетки с 37 градусов по Цельсию PBS и исправить их с 4%paraformaldehyde в PBS в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть фиксированные клетки три раза со свежим PBS за стирку и добавить минимальный объем флуоресценции монтажа среды на один микроскоп стеклянный слайд на образец.
Затем осторожно перенесите покрытые крышки на монтажные средства массовой информации с образцами, стоящими перед стеклянными слайдами. Чтобы изображение роста нейрита, выберите цель 40X на эпифлуоресцентном микроскопе и нажмите кнопку, чтобы захватить изображения, по крайней мере 40 нетронутых EGFP положительных нейронов на трансфекцию. Когда все невриты были изображены, откройте захваченные изображения в ImageJ с плагином NeuronJ и измерьте длину самого длинного нейрита каждого нейрона от клеточного тела до кончика конуса роста.
Затем проанализируйте данные, полученные с помощью программного обеспечения, чтобы определить влияние целевых белков на рост нейрита. Циточалазин D подавляет расширение нейрита в зависимости от дозы образом, в то время как нейритный рост усиливается в нейронах, обработанных фактором роста нерва. Кроме того, белок адаптера роста нейронов FE65 значительно стимулирует рост нейрита в два раза по сравнению с нетрансфицированными нейронами.
Несмотря на низкую эффективность трансфекции, иммунофлуоресценция анализ показывает, что более 80% двухдневной клеточной культуры могут быть успешно совместно с EGFP и FE65. Выражение EGFP обнаруживается в течение шести часов после трансфекции, в то время как FE65 впервые обнаруживается в час 12, и оба сигнала обнаруживаются на срок до семи дней после трансфекции. Трансфекция первичных корковых нейронов крысы с различным количеством плазмидной ДНК FE65 показывает доза-зависимое увеличение расширения нейрита с 0 до 0,5 микрограммов плазмиды FE65.
Однако существенной разницы в росте не наблюдается в нейронах, трансфицированных 0,5 или одним микрограммом плазмиды. При попытке протокола важно изолировать соответствующую область от эмбрионального мозга. Этот метод также может быть применен к изучению нервного роста в человеческих нейронов, полученных iPSC, которые имеют ценные инструменты для регенеративной медицины.
