Модель Alpha-Synuclein Preformed Fibril используется лабораториями по всему миру для изучения синуклеинопатий. Хотя модель успешно используется во многих лабораториях, некоторые группы испытали несоответствия генерации фибрилляций и производства последовательной альфа-синуклеин патологии. Мы надеемся, что этот протокол, в котором подробно генерации фибриллятов из альфа-синуклеин мономеров и использование предварительно сформированных фибриллы in vivo, может ответить на вопросы, которые исследователи имеют об использовании модели.
Модель Alpha-Synuclein Preformed Fibril резюмирует ключевые особенности болезни Паркинсона, такие как альфа-синуклеин патология и нейродегенерация. И было показано, что это приводит к скромным нарушениям двигателя в некоторых моделях животных. Формирование включений, содержащих фосфорилированный альфа-синуклеин и затяжной курс времени к нейродегенерации предлагает исследователям различные этапы на протяжении всего прогрессирования синуклеинопатии, для изучения и целевой для потенциальных терапевтических мероприятий.
Демонстрация подготовки пользовательских стеклянных игл, наш лаборант, Кристофер Кемп. Чтобы начать эту процедуру, оттепель альфа-синуклеин мономеров на льду. Повторно сожмите оттаяли мономеры, нежно щелкивая по трубке.
И центрифуга при 15 000 г и 4 градуса по Цельсию в течение 10 минут. Затем перенесите супернатант в чистую микро центрифугу объемом 1,5 мл и замигните переданную сумму. Разбавить мономеры с 1x dPBS до конечной концентрации 5 мг на мл.
Кратко вихрь смешать, и кратко центрифуги, чтобы собрать всю жидкость в нижней части трубки. Далее используйте клейкую пленку для защиты закрытой крышки трубки микро центрифуги. Поместите трубку в орбитальный термомешалка с крышкой в течение семи дней при 37 градусах по Цельсию при тряске при 1000 об/мин.
В конце семи дней содержимое трубки должно казаться мутным. Во-первых, дон все необходимые средства индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторное пальто, и щит для лица. Затем, в капоте клеточной культуры, прикрепите к преобразователь зонд диаметром 3,2 мм.
Установите амплитуду звуковых тока до 30%и пульс в одну секунду и одну секунду и время до одной минуты. Оттепель фибриллы при комнатной температуре, и еще в культуре капот, разбавить фибриллы с стерильной dPBS. Далее, ослабить ткани лаборатории с 70% этанола и использовать это, чтобы протереть зонд sonicator, чтобы очистить его.
Погрузите кончик зонда в двойную distiled воду и пульс 10 раз, чтобы очистить зонд дальше. После этого протрите зонд сухой лабораторной тканью. Поместите очищенный наконечник зонда в трубку разбавленных фибрилляций и распоите кончик в нижней части трубки.
Sonicate разбавленных фибрилляций, используя ранее установленные параметры при перемещении зонда вверх и вниз во время каждого импульса, чтобы убедиться, что все фибриллы в жидкости sonicated. После sonication, кратко центрифуга в течение одной секунды на 2000 г, чтобы собрать всю жидкость со стороны трубки. Погрузите наконечник зонда в 1%SDS и пульс 10 раз, чтобы очистить зонд.
Затем снимите наконечник с SDS и погрузите его в двойную дистиллированную воду и пульс в 10 раз. Протрите зонд лабораторной тканью, смоченной 70%этанолом, и протрите его сухой сухой лабораторной тканью. Отсоедините зонд от преобразователь и храните.
После этого протрите все поверхности в капюшоне с 1%SDS следуют 70%этанола. Для начала поместите силиконовую стеклянную капиллярную трубку в стеклянный шкив иглы. Включите нагревательный элемент и позвольте прикрепленным весам растянуть нагретую стеклянную капиллярную трубку.
Затем используйте ножницы, чтобы вырезать вытащил стеклянной капиллярной трубки в самой тонкой точке в середине и удалить стеклянную иглу из стекла иглы шкив. Затем используйте ножницы, чтобы сократить длину сужающейся оберточной трубки примерно до 40 мм. Сдвиньте сужаемую обертку над металлической иглой 10 микролитрового скошенного шприца.
Используйте открытое пламя, чтобы нагреть и прилипать к сужающейся обертке к игле, убедившись, что поверните иглу, чтобы равномерно нагреть. Сдвиньте больший конец вытянутой стеклянной иглы тщательно над металлической иглой шприца. После этого вырежьте длину сужающейся оберточной трубки примерно до 40 мм и аккуратно сдвиньте ее по стеклянной игле, чтобы перекрыть основание стеклянной иглы и металлической иглы шприца.
Используйте открытое пламя, чтобы нагреть сжатие обернуть для обеспечения стеклянной иглы к металлической игле. Для дальнейшего обеспечения иглы и предотвращения потенциальных утечек, сократить дополнительную длину сженного обертывания трубки примерно до 40 мм, и тщательно сдвиньте его по стеклянной игле, чтобы перекрыть основание стеклянной иглы и металлической иглы шприца. Используйте открытое пламя, чтобы нагреть сжатие обернуть для обеспечения стеклянной иглы к металлической игле.
Затем используйте ножницы, чтобы обрезать стеклянную иглу так, чтобы кончик был примерно 8 мм в длину. Чтобы проверить иглу, заполните 1 мл шприц с прилагается 26 калибровочных игл с дистиллированной водой. Удалите металлический поршень из пользовательского шприца стеклянной иглы и вставьте иглу заполненного водой шприца в основание пользовательского шприца.
Осмотрите интерфейс стеклянной иглы и металлической иглы на наличие утечек и подтвердите устойчивый поток воды. Затем заполните микро центрифугу трубку дистиллированной водой. Используйте пользовательский шприц стеклянной иглы, чтобы привлечь в дистиллированной воде.
Осмотрите иглу, чтобы подтвердить, что жидкость попадает в шприц и что пузырьков нет. Если есть пузырьки, или если вода не обращается в иглу, обрезка иглы может помочь облегчить давление. После этого тщательно храните шприц с прикрепленными стеклянными иглами, в шприц-боксах до необходимости для операций.
Экспертиза с помощью трансмиссионной электронной микроскопии подтверждает наличие длинных фибрилляций. Для сравнения, мономеры альфа-синуклеина видны ячменем и не имеют заметной формы. Анальоидное подтверждение фибрилляции затем подтверждается с помощью Thioflavin T Assay.
Репрезентативный анализ показывает, что мономеры dPBS и мыши производят более низкий сигнал в относительно мучных единицах по сравнению с мышиными ПФФ. Мономер альфа-синуклеина человека производит аналогичный сигнал мономеру мыши. В то время как человеческие ПФФ также производят более высокий сигнал, чем мономеры.
Чтобы ослов наличие pelitible фибрилляции, осадочный анализ выполняется. Как в образцах мыши, так и в образцах PFF, супернатное нарушение должно иметь больше белка в гранулах, чем супернатант. В отличие от этого, большая часть белка от мыши и человека мономеров присутствует в супернатанте с небольшим количеством присутствующих в гранулы.
Как мыши, так и человека PFFs sonicated производить PFFs соответствующей длины для посева альфа синуклеин включений. Комплексное обследование примерно 500 фибрилл показывает, что средняя длина фибрилляций мыши составляет около 44 нанометров. С 86,6% ПФФ измерения 60 нанометров или меньше.
Человеческие ПФФ, однако, имеют среднюю длину около 55,9 нанометров с 69,6% ПФФ размером 60 нанометров или меньше. In vivo исследование эффективности PFF подтверждается с помощью иммуногистохимии. Включения, образованные в substantia nigra, имеют схожие свойства с телами Леви в том, что они содержат фосфорилированный альфа-синуклеин, содержат амиллоиированные структуры и пятна с тиофлавином S, и устойчивы к пищеварению Proteinase K.
Sonication может подвергать отдельных sonicating аэрозолизированных преформированных фибрилляций. Таким образом, надлежащее одеяние безопасности следует носить и sonication выполняется в капюшоне, чтобы свести к минимуму риск воздействия.
