DREADDs являются самым популярным химиогенетическим подходом для дистанционного управления нейронной активностью. Здесь мы предлагаем новые альтернативы для повторяющихся или хронических DREADD контроля, сосредоточив внимание на менее инвазивных методов доставки CNO. Мы описываем две стратегии для длительной доставки CNO у мышей с помощью повторяющихся глазных капель, или хронически через питьевую воду животного.
Описанные здесь протоколы являются примерами хронических и неинвазивных вариантов доставки CNO, которые могут быть адаптированы к различным экспериментальным проектам, включая различные варианты DREADD, ткани или даже виды. Ключевым вопросом для доставки CNO является стресс и боль животного. Эти протоколы сводят к минимуму эту проблему и просты в работе и адаптации к различным экспериментальным настройкам.
Перед операцией очистите и стерилизовать стереотаксис и все необходимые инструменты. Когда рама будет готова, подтвердите отсутствие реакции на щепотку ноша в анестезированом смешанном фоне дикого фона мужской мыши, побрите верхнюю часть головы и зафиксните голову мыши к раме. Затем нанесите глазную защитную смазку на глаза и, наконец, очистите обезвемую кожу последовательным йодом повидоне и 70%этанолом скрабами.
Используйте стерильный скальпель, чтобы разоблачить череп и откалибровать раму до точки брегмы. Сверлить при medialateral координаты 2,9 миллиметра, и передней задней координаты минус 2,7 миллиметра для целевой гиппокампа. Когда мозг подвергается воздействию, используйте микро инжектор и вытащил микрокапильярные пипетки в одностороннем порядке вводить 90 нанолитров аденоассоциированного вируса в гиппокампе на спинной брюшной глубине минус три миллиметра.
Затем закройте разрез нейлоновыми швами и удалите животное из рамы для введения анальгезии. Для повторяющихся CNO доставки, начиная четыре недели после инъекции, акклиматизировать животных к обработке, потертые каждой мыши три минуты в день в течение трех-четырех дней до введения глазных капель. Когда мыши приспособятся к обработке, взвесить каждую мышь, чтобы определить соответствующее количество CNO, которые будут доставлены для достижения одного миллиграмма CNO на килограмм концентрации массы тела.
За два часа до выключания света во время неактивной фазы загрузите от одного до трех микролитров подготовленного раствора CNO в микропипют P10 и обездвижите мышь с помощью scruffing. Медленно изгоните раствор до тех пор, пока на кончике пипетки не образуется стабильная капля, и осторожно принесите каплю близко к роговице до тех пор, пока раствор не будет доставлен, не касаясь кончика пипетки к глазу мыши. Затем верните мышь в свою домашнюю клетку, прежде чем применять CNO eyedrop к глазу следующего животного.
В тех случаях, когда CNO необходимо доставить во время активной фазы мыши, обеспечить наличие тусклого красного света для надлежащего обращения с животными и доставки CNO. Для хронической обработки CNO, начиная с четырех недель после инъекций и за три дня до начала лечения, заменить обычные бутылки с водой с небольшими бутылками остановился с резиновыми носиками и покрыты алюминиевой фольгой, содержащей 10 миллилитров обычной воды. Защищите клетки скотчем, чтобы мыши могли акклиматизироваться к бутылкам.
Измерьте ежедневное потребление воды для каждой мыши и взвесьте каждую мышь. Проверьте диапазон концентраций CNO, чтобы определить дозу, которая отображает максимальную эффективность с минимальной концентрацией CNO. Затем заполните каждую маленькую бутылку восемью миллилитров обычной воды плюс необходимое количество CNO.
Для ограниченной обработки CNO, начиная четыре недели после инъекции и за три дня до начала лечения, поместите небольшую бутылку, содержащую 10 миллилитров воды плюс 1% сахарозы на клетке от оригинальной бутылки воды во время последней части активной фазы животного. В конце экспозиции удалите воду плюс растворы сахарозы из каждой клетки и измерьте потребление воды сахарозы для каждого животного. Для доставки CNO, заполнить бутылки с пятью миллилитров воды плюс 1% сахарозы и один миллиграмм на килограмм CNO.
Поместите бутылку в том же положении, что и в период акклиматизации сахарной воды во время последней части активной фазы, удаляя бутылки и измеряя количество воды, сахарозы и CNO потребляется, как попродемонстрировано. В конце эксперимента, урожай обработанных животных мозга в свежий фиксатор. После 9 до 12 часов, криопротезатор ткани мозга в 30% сахарозы раствора.
Когда мозг тонет, раздел образца на криостат. Когда все секции мозга были получены и неспецифические связывания заблокированы, инкубировать образцы тканей с анти-c-Fos антитела решение при четырех градусах по Цельсию ночь с постоянным возбуждением. На следующее утро, мыть образцы с трех пятиминутных моет в свежем PBS за стирку перед инкубацией образцов с соответствующим флуоресценции конъюгированных вторичных антител.
После одного часа при комнатной температуре и постоянном возбуждении, защищенном от света, получить цифровые изображения помеченных секций тканей с помощью флуоресцентной конфокальные микроскопии. После загрузки изображений в ImageJ, наброски при измерении областей Адено связанных инфицированных mCherry положительных клеток и количественно количество C ложноположительных клеток в этой области, чтобы получить количество активированных клеток в области. Повторяющиеся поставки CNO с помощью глазных капель вызывает надежную индукцию экспрессии cFos в большинстве инфицированных нейронов, демонстрируя, что эффективность доставки CNO поддерживается во время повторяющегося воздействия.
Кроме того, значительная индукция cFos наблюдается в образцах, собранных через два часа после обработки CNO по сравнению с образцами, полученными через шесть часов после воздействия CNO, что указывает на то, что изменения, вызванные CNO, зависят от времени. Ежедневное потребление воды плюс CNO существенно не отличается от общего объема потребляемой обычной воды. Аналогичным образом, количество воды плюс 1% сахарозы потребляется в ночное время не зависит от добавления CNO, равно как и различия в ежедневном потреблении воды плюс CNO, и вода плюс сахароза плюс CNO наблюдается в течение пяти дней экспериментального периода.
Подобно применению CNO eyedrops, надежная индукция cFos наблюдается после двух, но не шести часов доступа к питьевой воде CNO. Кроме того, существует четкий порог эффективности для CNO, как низкая доза CNO не вызывает активации cFos по сравнению с солевым контролем, в то время как более высокие дозы вызывают надежные и аналогичные индукции cFos. Мы рекомендуем выдать анализ реакции дозы, чтобы определить самую низкую дозу CNO, которая не значительно снижает активацию нейронов, и рассматривая использование клозапина в качестве лиганда.
Здесь мы продемонстрировали использование CNO-опосредованной индукции cFos в результате активации нейронов. Тем не менее, эти протоколы могут быть легко приняты для электрофизиологического анализа или поведенческих тестов. DreadD технология является мощным инструментом для дистанционного управления нейронной активности, а также разработки альтернативных стратегий для доставки CNO.
Мы увеличим спектр вариантов экспериментальных условий и потенциальных клинических вмешательств.
