Используя этот метод, мы можем непосредственно изучат образование сердечной трубки, цикл и полное образование камер без дальнейших экспериментальных манипуляций эмбриона мыши. Хотя, мы используем MLC-2v-tdTomato мышей в качестве примера, этот простой метод может быть широко использован с другими флуоресцентными линиями мыши репортера. Основным преимуществом этого протокола является то, что он очень прост и не требует каких-либо сложных методов или оборудования.
Это может быть выполнено в обычной обстановке лаборатории. После спаривания самки с мышами мужского пола, как MLC-2v-tdTomato от 8 до 10 недель, проверить плотины для вагинальных пробки каждое утро. Положите беременных плотин, усыпляют в разные дни после coitum, в положении на спине и спрей живота с 70%этанола.
Используйте острые хирургические ножницы и миппы, чтобы открыть брюшную полость путем разреза кожи и брюшной стенки. После обнаружения двусторонних рогов матки в спинной части брюшной полости, отделить всю матку с помощью острых хирургических ножниц и типсов, чтобы тщательно сократить выше яйцеклетки с обеих сторон. Поместите всю вскрытую матку в 10-сантиметровую чашку Петри с ледяной PBS.
Используя острые хирургические ножницы и типсы, тщательно отделяйте каждый амниотический мешок вдоль рога матки. Используйте пинцет для переноса каждого эмбриона в 35-миллиметровую культурную пластину, наполненную ледяным PBS. Используя острые хирургические ножницы и типсы, откройте амниотический мешок и разоблачите каждый эмбрион, отрезав пуповину, а затем обрежьте дополнительные эмбриональные ткани как можно больше, не повреждая эмбрионы.
Под рассеченным микроскопом с помощью волоконно-оптического микроскопа иллюминатор отрежьте голову эмбриона и перенесите его в 1,5 миллилитровую трубку со 100 микролитров буфера А для более поздних генотипирования, чтобы соотнести с результатами эпифлуоресцентной визуализации. Используя тонкие миппы, откройте грудную клетку эмбриона. Острыми хирургическими ножницами и типсами удалите сердце из легких и сосудов.
Используйте пинцет для переноса расчлененного эмбрионального сердца в 35-миллиметровую культурную пластину с ПОМОЩЬю PBS. Поместите пластину с эмбриональными сердцами мыши под эпифлюоресцентным рассечением микроскопа. Используйте тонкие миппы, чтобы распоставить эмбриональные сердца таким образом, чтобы развивающие желудочков сталкиваются с экспертом.
Отрегулируйте фокус с помощью 0,63-х объектива в режиме яркого поля. Возьмите ярко-полевых экспозиций и захватить несколько изображений. Чтобы визуализировать экспрессию tdTomato, выключите микроскоп и установите фильтр для красной флуоресценции.
При необходимости отрегулируйте фокусировку изображения, отрегулируйте яркость и контрастность, сделайте краснофлуоресцентные экспозиции и захватите несколько изображений. Для генотипирования эмбрионов кипячение ранее изолированных образцов головы в буфере А при 100 градусах Цельсия в течение 30 минут. Центрифуга в течение двух минут в 11, 360 раз G.Transfer 20 микролитров супернатанта в новую 1,5 миллилитровую трубку с 20 микролитров буфера B и смеси.
Используйте 4,5 микролитера смешанного супернатанта в качестве шаблона ДНК и объедините его с 0,5 микролитров каждого из 10 микромолярно-специфических форвардов и реверсивных грунтовок, 10 микролитров полимеразы и буфера реакции 2x-premixed, а затем добавьте воду в общий объем 20 микролитров. Запустите ПЦР, как описано в рукописи. Загрузите завершенную реакцию в 100 базовой паре ДНК лестницы на 1%agarose гель и запустить на 140 вольт в 1x TAE буфера в течение 25 минут.
Поместите завершенный гель на УФ-трансиллюминатор и включите ультрафиолетовый свет для идентификации полос ДНК. MLC-2v считается самым ранним маркером для желудочковой камеры спецификации во время развития сердца. В MLC-2v-tdTomato репортер стук в мышей, относительно слабое выражение tdTomato в линейной трубке сердца на E8.0 становится сильнее на E8.5, как показано с помощью цельно-монтировать эпифлурелсцентные изображения эмбрионов.
Используя цельно-монтирующий эпифлурелсцентное изображение расчлененного сердца, образование желудочковой камеры во время развития сердца мыши можно легко определить. В расчлененном сердце от целого эмбриона мыши на E10.5, MLC-2v-tdTomato выражение репортера было показано в желудочковой части сердца, а не в тракте притока, отток тракта, или будущее atria. На E12.5 до E13.5, tdTomato репортер исключительно выражается в желудочках четырехколесного сердца.
Аналогичная модель экспрессии желудочков была показана в расчлененном эмбрионе мыши на E16.5. После целой визуализации генотип эмбрионов был определен с использованием двух наборов грунтовок для генотипирования ПЦР, подтверждающих гомозиготные эмбрионы, несущие аллель tdTomato knock-in, гетерозигот и эмбрионы дикого типа. Этот метод довольно прост и прост в работе.
Критическим шагом является вскрытие эмбриональных сердец. Понимание сердечной анатомии во время развития сердца необходимо для успешной изоляции сердца от всего эмбриона.
