Структурированная микроскопия освещения супер-разрешения, 3D-SIM, является инновационным методом визуализации флуоресцентных белков репортеров кластеров прорастающих рецепторов в споро-мембранах. Используя эти процедуры, непревзойденное разрешение зародышевой локализации и споры внутренней мембраны липидных областей могут быть достигнуты. Технику продемонстрируют аспирант Хуан Вэнь и магистр наук Раймонд Пасман из нашей лаборатории.
Перед началом процедуры очистите высокоточные крышки одномололярной соляной кислотой в течение 30 минут в нежно трясущимся водяной бане, после чего две-пять минут промывают в ультрапурной воде типа 1. После второй стирки поместите крышки в 100%этанол в течение примерно трех минут до высыхания крышки и проверки их ясности. Затем, чистый стеклянный микроскоп слайды с 70% этанола в течение одной минуты, прежде чем позволить слайды высохнуть и проверки их ясности.
Для флуоресцентной микросферы и споры изображения, первый предварительно теплый два слайда на 70-градусный блок отопления по Цельсию в течение нескольких секунд, прежде чем добавить 70-градусный по Цельсию, 65-микролитр капли стерилизованных 2%agarose на одном из слайдов. Поместите другой слайд на вершине, чтобы распространить агарозу между слайдами. Через пять минут снимите одну из горок и разрежьте высушенную агарозу на секцию один на один сантиметр.
Добавьте один раз 10 к восьмой флуоресцентной микросфере или спорам в 0,4 микролитерах стерильной, ультрапурной воды типа 1 к агарозе и поместите высокоточную крышку на патч с помощью крышки, чтобы сдвинуть патч со слайда на поверхность крышки. Затем закрепим 65-микролитер 1,5 на 1,6-сантиметровый генный каркас на высушенную горку и поместите крышку на раму, закрыв все углы рамы. Для визуализации образцов поместите слайд на структурированный микроскоп освещения, оснащенный 100X масляной целью, и сосредоточьтесь на 100-нанометровых флуоресцентных микросферах.
Отрегулируйте кольцо коррекции на цель 100x до тех пор, пока не будет получена симметричная функция распространения тока, чтобы свести к минимуму размытие изображений, и выберите поле зрения с приблизительно 10 круглыми флуоресцентными микросферами. Примените регулировку фокусировки решетки для обозначенных длин волн возбуждения, в данном случае 561 и 488 нанометров, в качестве руководства для программного обеспечения анализа изображений, прежде чем сосредоточиться на спорах со светом передачи. Захват светового изображения передачи в среднем режиме 16x с 20-миллисекундной экспозицией для каждого изображения.
Затем захват 3D-структурированного освещения микроскопа сырые флуоресцентные изображения спор с режимом освещения 3D-SIM. Для реконструкции среза нажмите Param на структурированный лист вкладки осветительные площадки, чтобы открыть окно N-SIM Slice Reconstruction. Следуйте предложенным инструкциям, и нажмите на соответствующие элементы управления, чтобы установить контраст модуляции освещения к авто, подавление шума высокого разрешения до одного, и из фокуса подавления размытия до 0,05 в качестве отправной точки.
Затем щелкните Reconstruct Slice, чтобы реконструировать изображение и оценить качество реконструированных изображений по быстрому преобразованию изображений и оценке реконструкции, которые отображаются после реконструкции. Отрегулируйте шум с высоким разрешением от 0,1 до 5, а подавление размытия фокуса - с 0,01 до 0,5 до получения наилучших параметров. Затем нажмите Применить применить изменения.
Нажмите близко, чтобы закрыть окно. Откройте FM4-64 окрашенных PS4150 споры сырья изображения. Затем щелкните Reconstruct Slice, чтобы выполнить реконструкцию среза и сохранить реконструированное изображение.
Для преобразования 3D-SIM сырые изображения КГБ80 geminosome в псевдо-широкое поле изображения, слева нажмите на ImageJ SIMcheck плагин и выберите сырье данных SI и Pseudo Widefield. Случайно выберите около 25 спор в каждом перевернутом изображении передачи для более позднего герминомического анализа в флуоресцентных псевдо-широких изображениях до тех пор, пока не будет выбрано около 350 спор. Затем используйте ImageJ для оценки максимальной интенсивности каждого флуоресцентного сигнала, выраженного каждой группой спор, и комплексной интенсивности каждого 3D-изображения спор.
Для анализа псевдо-широкой полевых изображений germinosome KGB80, используйте среднее интегрированное значение интенсивности семи стеков в качестве интегрированной интенсивности сигнала споры KGB80. Затем определите интенсивность фона, изобразив фоновый штамм PS4150 с использованием одинаковых настроек, и посвястите флуоресцентные пятна в отдельных спорах КГБ80 зародышами, когда они четко различимы от фона. В этом репрезентативном эксперименте два очага флуоресцирования спор GerD-GFP появились в разных стеках с тремя общими очагами GerD-GFP, наблюдаемыми в композитном стеке No3.
Здесь была замечена спора только с одним координационным центром GerD-GFP в спорах. В общей сложности от 40 до 50% спор имели два или один кластер GerD-GFP и GerKB-mCherry, соответственно. В то время как интегрированная интенсивность белка леса GerD-GFP отличалась между различными популяциями, интегрированная интенсивность GerKB-mCherry была примерно одинаковой в разных популяциях.
Когда споры имели несколько очагов, максимальная интенсивность флуоресценции GerD-GFP и GerKB-mCherry foci, как правило, уменьшалась, а максимальная флуоресценция всех ярких пятен, считаются зародышевой foci, была выше, чем максимальная аутофлуоресценция спор PS4150. Примечательно, что более яркие пятна FM4-64, похожие на зародышевые очаги, появляются как в нетронутых, так и в декотированных спорах PS4150, что позволяет предположить, что эти яркие пятна FM4-64 могут быть вовлечены в кластеризацию зародышевых белков во внутренней мембране. Добавление спор в агарозу и размещение агарозы в раме требует непрерывного и тщательного движения жидкости для этих мини-материалов.
Преобразование необработанных изображений 3D-SIM КГБ80 в псевдо-широкое поле изображения и их интерпретация требует экспертных знаний по биологии спор. Наша структурированная процедура микроскопии освещения может быть применена к изображению низких обильных белков или тусклых флуоресцентных репортеров в различных бактериях или других материалах полосы. Организация герминосомы теперь может быть изучена с помощью процедур двойной маркировки для оценки совместной локализации белков прорастания Bacillus и конкретных мембранных областей.
