Использование только модели для разработки гепатоцеллюлярной модели массы рака может помочь людям прояснить их опухолевых иммунотолеранс и конкретные лечения индуцированных, любые иммуноответчики опухоли. Ортопедическая опухоль, которая развивается с помощью метода фиброза печени, имитирует клинические особенности рака печени человека. Этот метод может обеспечить полезный инструмент в гепатоцеллюлярной иммунологического исследования рака.
Визуальная демонстрация этого метода может проиллюстрировать более технически сложные шаги, такие как внутрипленичная инъекция, которые необходимы для успешного выполнения этого протокола. Далее, вручную сдерживать мужчину, от шести до восьми недель C57 черный 6 мыши спинной стороне вверх. Используйте альтернативные 70% этанола и бетадина скрабы для очистки места инъекции три раза.
Затем доставить 160 микролитров тетрахлорида углерода к мыши путем внутриперитонеальной инъекции и вернуть животное в свою домашнюю клетку. После подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноша, в пятимесячный вирус simian 40 T антиген трансгенной мыши, поместите мышь в положение на спине и обеспечить конечностей с лентой. Сделайте разрез лапаротомии средней линии по длине линии альба, достаточно большой, чтобы обеспечить адекватное воздействие печени, и вытеснить кишечник влево.
Рассекаете над печенью воздействие нижней кавы вены. Индуцировать зажим артерии, чтобы ligate сосуда. Используйте иглу бабочки, чтобы получить внутривенный доступ к вене портала и вручную обеспечить катетер.
Тщательно переключив шприцы для каждого раствора, успешно поставить 15 миллилитров раствора один, 15 миллилитров 0,75%коллагеназы раствор два, и 15 миллилитров раствора два без коллагеназы через катетер, при приблизительном 8,9 миллилитров раствора в минуту скорости потока. В конце перфузии, урожай массы опухоли в 50-миллилитровой конической трубки, содержащей от 10 до 15 миллилитров PBS. Акциз опухоли от следующего MTD2 мыши, как только что продемонстрировали.
Используйте ножницы, чтобы разрезать печень на более мелкие кусочки. Перенесите ткани в новый контейнер свежего PBS, чтобы удалить остальную часть крови из ткани перед передачей частей ткани в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую пять миллилитров полной среды RPMI. Фарш мыть образцы печени, пока куски могут поместиться легко через кончик пятими миллилитров пипетки.
Добавьте достаточно среды в трубку, чтобы достичь конечного объема в 30 миллилитров. Используйте пятими миллилитровую пипетку, чтобы тритурировать фрагменты ткани, прежде чем фильтровать раствор через 70-микрометровый ситечко в новую 50-миллилитровую трубку. Вымойте ситечко несколько раз с полной среды.
Отрегулируйте конечный объем до 50 миллилитров с дополнительной полной средой. Быстро вращаем подвеску центрифугой максимум до 50 раз г, прежде чем остановить центрифугу и высасыть супернатант. Затем повторно посовечите гранулы в 20 миллилитров PBS для подсчета.
Для внутриспленичной инъекции гепатоцитов MTD2 загрузите одноми миллилитровый шприц, оснащенный иглой 27-го калибра на каждого животного-получателя с 220 микролитров гепатоцитов на мышь. Подтвердите отсутствие реакции на щепотку ноша в анестезированом, углероде тетрахлорид-обработанном животном. Начиная чуть ниже мышцы позвоночника, далее, сделать один сантиметр разрез на левом фланге параллельно тринадцатого ребра от спинного экстрема и использовать тупоконечные миппы для экстерьеризации селезенки.
Затмить селезенку двумя титановыми зажимами среднего размера между селезенкой и веной, а также доставить 200 микролитров клеток в нижний полюс селезенки. Клип нижней ветви pedicle с одним среднего клипа и сократить селезенку между двумя первоначально размещенных клипов. Удалите нижний полюс селезенки, который был непосредственно введен с опухолевыми клетками и использовать 3-0 полиглактина 910 прервал заковы, чтобы закрыть внутренний мышечный слой.
Затем используйте стерилизованные стальные зажимы для ран, чтобы закрыть внешний слой кожи и подкожно управлять пять миллиграммов на килограмм карпрофена. После изоляции от Т антигенных трансгенных мышей, как попродемонстрировано, как гепатоциты и опухолевые проникающие клетки могут наблюдаться. Клетки обычно демонстрируют почти 100%-ную жизнеспособность после обработки.
После внутрипленичной прививки в дикого типа углерода тетрахлорид-обработанных животных, пересаженные гепатоциты успешно и надежно растут ортопедические гепатоцеллюлярные опухоли карциномы, которые выражают опухолевидно-специфический симианный вирус 40 Т антиген. Подготовка нашей жизнеспособной и чистой популяции гепатоцитов из массы MTD2 и точное введение внутриплениковой инъекции имеют важное значение для успеха процедуры. Хотя наша команда протестировала прививку гепатоцитов у мышей-реципиентов с помощью внутрисосудистой и внутриперитонеальной инъекции, эти другие методы не смогли вызвать ортопедическую гепатоцеллюлярную карциному.
Эта модель обеспечивает уникальную платформу, позволяющую исследование для иммунного наблюдения и толерантности в его ранних и поздних стадиях прогрессирования опухоли. Пожалуйста, будьте осторожны при использовании тетрахлорида углерода, так как он токсичен.
