Этот протокол имеет важное значение по двум основным причинам. Во-первых, это позволяет пользователю быть в состоянии определить состояние клеточного цикла клеток кожи, которые были изолированы от модели животных. Это также позволяет нам анализировать экспрессию белка в дискретных фазах клеточного цикла.
По сравнению с предыдущими методами определения пролиферации клеток, наш метод позволяет более точно определить различные фазы клеточного цикла, и мы также можем проанализировать более 40 различных маркеров на различных стадиях деления клеток. Это значительно повышает применение и универсальность метода. Этот протокол может быть использован в исследованиях рака и в любом другом типе заболевания, где есть необходимость определить клеточный цикл конкретных моделей выражения белка.
Кроме того, этот протокол может быть изменен на другие типы клеток, а также в других модельных организмах. В первый раз пользователь должен сосредоточиться на получении наилучшего качества подготовки клеток возможно. Это требует своевременной обработки экспериментальной кожи с использованием свежих реагентов, минимального времени пищеварения тканей и тщательного удаления супернатанта после центрифугации для сохранения целостности и количества клеток.
Для начала разработать металлическую панель антител с использованием бесплатного программного обеспечения для проектирования онлайн-панелей, как описано в рукописи. Затем приготовьте раствор бульона IdU, растворив порошок IdU при 10 миллиграммах на миллилитр при норме гидроксида натрия при 60 градусах Цельсия. После aliquoting IdU фондовый раствор в микроцентрифуг труб, заморозить их при температуре минус 20 градусов по Цельсию для длительного хранения.
Непосредственно перед использованием, отрегулируйте рН раствора IdU до 7,5 с 12 нормальной соляной кислотой, и проверить с полосой рН на отбрасывать aliquot для обеспечения решения на рН 7,5. Чтобы подготовить два х параформальдегид фиксации раствора, объединить пять миллилитров 10 х PBS и один миллилитр 16%PFA с 44 миллилитров чисто молекулярного класса дистиллированной воды. Для приготовления 100-миллиметрового раствора цисплатина растворяют 300,5 миллиграммов порошка цисплатина в 10 миллилитров ДМСО.
Для экспериментов, которые будут использоваться в течение одного дня, подготовить 10 миллимолярд цисплатин рабочий раствор. Взвешивание мышей, а затем определить дозу на 0,1 миллиграмма IdU на грамм массы тела. Администрирование рассчитанной дозы ПИН путем внутриперитонеальной инъекции, и ждать в течение двух часов до сбора клеток.
Используйте ножницы хирургического класса, чтобы хирургическим путем удалить ухо усыпляемой мыши, ранее введенной с IdU у основания уха. Поместите ухо на сухую 100-миллиметровую чашку Петри. Тщательно отделить переднюю от задней кожи с помощью тонкой типсов для создания кармана в середине или краю области разреза, а затем вытащить два лоскута кожи друг от друга, и приступить как передние и задние шкуры.
Аккуратно поместите переднюю и заднюю шкуры одного уха в один колодец 12-хорошо культурной пластины, наполненной одним миллилитром свежеприготовленного раствора диспазы/коллагеназы, при этом дерма-сторона кожи касается раствора. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы переварить кожу. Поместите переваренное ухо или неонатальной кожи в чистую чашку Петри с эпидермис стороны касаясь поверхности блюда.
Используя щипцы, сгладить кожу и осторожно сдвиньте дерму от эпидермиса, работая от центра к краям в круговой узор. С типсами, захватить эпидермис по краям и осторожно снять его, счистив его от поверхности чашки Петри. Аккуратно поместите эпидермис на предварительно разогретый раствор клеточного отслоения в один колодец тарелки.
Инкубировать в течение пяти минут при температуре 37 градусов по Цельсию или 20 минут при комнатной температуре. Используйте стерильные щипцы, чтобы схватить эпидермис и скраб, перетащив эпидермис против нижней части блюда, чтобы разобщить клетки. Добавьте один миллилитр DMEM, содержащий 1%FBS, и пройдите через сито 40 микрометровых клеток в трубку для сбора.
Хорошо промыть дополнительными двумя миллилитров DMEM и добавить к подвеске клетки. После центрифугирования при 120 раз г в течение пяти минут, тщательно аспирировать супернатант. Resuspend ячейки гранулы в один-два миллилитров DMEM, содержащих 1%FBS, и гранулы клетки снова, как и раньше.
Чтобы маркировать клетки для определения живых и мертвых клеток, повторно поместью от одного до трех миллионов клеток в один миллилитр DMEM, содержащий 25 микромолярный цисплатин и инкубировать в течение одной минуты. Утолить трубой с равным объемом FBS. После центрифугирования в 120 раз г в течение пяти минут, decant supernatant в стакан, содержащий разбавленный отбеливатель, и инвертировать трубки для слива оставшегося раствора на бумажное полотенце.
Повторное распределение клеточных гранул в двух миллилитров бария катиоции свободной PBS, и центрифуги их снова, как описано ранее. Чтобы исправить клетки, повторное распределение гранулы клетки в один миллилитр бария каника свободной PBS. Vortex клетки под непрерывной низкой мощности и добавить один миллилитр из двух х PFA фиксации буфера падение мудрым.
Поместите на качалку платформу и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. После центрифугирования при 500 раз г в течение пяти минут, тщательно декантировать супернатант. Вымойте клетки с двумя миллилитров бария катиоции свободной PBS, центрифуга снова в тех же условиях, и повторить шаг стирки.
Наконец, повторное распределение гранул в двух миллилитров бария катиоции свободной PBS. Центрифуга клетки в 500 раз г в течение пяти минут и тщательно декантировать супернатант. Переподходьте клетки в один миллилитр одного буфера фиксации x и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут и повторите центрифугу.
Чтобы промыть клетки, добавьте один миллилитр буфера пермяки штрих-кода. Во время центрифугации клеток при 500 г в течение пяти минут, подготовить штрих-коды, добавив 100 микролитров буфера пермялизации штрих-кода к ним, и немедленно перемешать. Повторное производство клеточных гранул в 800 микролитров буфера пермеабилизации штрих-кода.
Добавьте решение штрих-кода в клетки, перемешайте и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Центрифуга по 500 раз г в течение пяти минут. Вымойте клетки в двух миллилитров буфера окрашивания клеток и центрифуги снова.
Далее, resuspend от одного до трех миллионов клеток в один миллилитр ядерного антигена окрашивания буфера рабочий раствор, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. После центрифугирования при 500 раз г в течение пяти минут, тщательно декантировать супернатант. Resuspend клетки в один миллилитр ядерного антигена окрашивания пермяки буфера и центрифуги снова.
После повторного повторного успения и центрифугации, повторное распыление клеточной гранулы в остаточном объеме с нежным вихрем. Добавьте 50 микролитров внутриклеточного коктейля антител, смешайте и инкубировать при комнатной температуре в течение 45 минут. Добавьте два миллилитров буфера окрашивания клеток.
Центрифуга снова в тех же условиях, что и на предыдущем этапе, и удалить супернатант. Переусердствов гранулы в двух миллилитров буфера окрашивания клеток, центрифуги в 500 раз г в течение пяти минут, и повторить повторное перерасход и центрифугации. Перерасходовать клетки в один миллилитр раствора интеркаляции, и хранить в течение одного-трех дней при четырех градусах цельсия.
После центрифугирования клеток снова, мыть гранулы с двумя миллилитров буфера окрашивания клеток, центрифуги в тех же условиях, и выполнить два дополнительных моет с двумя миллилитров воды, с той же центрифугации. Переусейте клеточные гранулы при концентрации одного миллиона клеток на миллилитр с разбавленным раствором шарика эквалайзера, а затем запустите образцы на масс-цитометре. Определены ожидаемые выходы клеток и жизнеспособность взрослого уха мыши и неонатальной кожи.
Приблизительная урожайность зависит от площади поверхности кожи. Неонатальной кожи является лучшим выбором для экспериментов, которые требуют большего количества клеток. Показана основная стратегия выбора нетронутых, одиночных и жизнеспособных ячеек после нормализации и деконволюции данных цитометрии штрих-кодов массы.
Процент жизнеспособных клеток может свидетельствовать о качестве или состоянии клеток до окрашивания. Различия в жизнеспособности между культурными клетками карциномы по сравнению с изолированными клетками уха мыши показаны, тоже. Жизнеспособные клетки были закрыты по длине события по сравнению с CD45, чтобы исключить гематопоэтические клетки.
Включение маркеров линии позволяет от выбора популяций клеток, представляющих интерес в различных фазах клеточного цикла. Основной профиль клеточного цикла получен путем обнаружения BrdU по сравнению с PI в флуоресцентной цитометрии потока. Однако включение других маркеров пролиферации с массовой цитометрией позволяет более точно идентифицировать фазы клеточного цикла.
Следуя этому подходу, профили клеточного цикла могут быть построены для различных типов клеток или экспериментальных условий, таких как профили для отрицательных CD45 по сравнению с положительными клетками CD45 из одного и того же эксперимента. В другом примере анализ маркеров, определяющих сигнальные пути EGFR и mTOR PI3K в фазе G-one, выявил аналогичные профили экспрессии в отрицательных клетках CD45, показанных оранжевым цветом, и положительные клетки CD45, показанные синим цветом. Массовая цитометрия требует большого количеством высококачественных клеток.
Если пользователь заинтересован в редкой популяции клеток, может потребоваться большее количество ячеек. Изолированные живые клетки могут быть использованы для анализа ДНК или РНК, биохимических исследований, или могут быть использованы в культуре тканей до фиксации и окрашивания для массовой цитометрии. Пользователь должен использовать оборудование личной защиты и шкаф безопасности, когда это необходимо, при работе с параформальдегидом, соляной кислотой или гидроксидом натрия.
