Этот воспроизводимый и простой в использовании протокол использует ex-vivo лимфатических узлов визуализации стратегии для отслеживания слива in-vivo вводят флуоресцентные помечены антитела к местным вторичным лимфоидных органов. Демонстрация этого метода позволяет специфическую визуализацию процедуры, что может способствовать успешному выполнению протокола. Это очень простой и простой метод, который может быть выполнен кем угодно.
Единственным сложным аспектом является обработка мыши, которая требует некоторой подготовки. Этот метод имеет преимущество улучшенной скорости ткани напряжения сохранения и жизнеспособности клеток по сравнению с обычными флуоресцентными методами окрашивания. Обучение процедуры будет Бруна Tatematsu, техник из лаборатории.
Разбавить антитела интереса, спрягается с соответствующими флюорофорами, в 100 микролитров PBS для визуализации пахового лимфатического узла, или 50 микролитров PBS для popliteal лимфатических узлов изображений. Для визуализации пахнутых лимфатических узлов загрузите 100 микролитров коктейля антител в один миллилитр инсулиновый шприц, оснащенный 30 калибровочных по половине дюйма иглой, и подкожно ввилите антитела во внутреннее бедро экспериментальной мыши. Для popliteal лимфатических узлов изображения, вводить 50 микролитров антитела коктейль подкожно в одну лапу площадку экспериментального животного.
Затем верните животное в свою домашнюю коробку. Для сбора инъекционных дренажных лимфатических узлов, после ожидания не менее трех часов после инъекции, обездвижить мышь на акриловой сцене клейкой лентой и применить минеральное масло для брюшной кожи. Используйте стандартные ножницы микрохирургии и микрохирургии изогнутые миппы, чтобы сделать разрез средней линии кожи в брюшной полости от лобка к процессу ксифоида, и отмежеваться от брюшной мускулатуры от кожи.
Сделайте горизонтальные разрезы кожи в верхней и нижней части вертикальной линии разреза, чтобы создать лоскуты кожи на стороне инъекции, и втягивать кожу, чтобы визуализировать лимфатический узел. Закрепнешь лоскут кожи к акриловой пластине, и используйте щипец для удаления полупрозрачных, как правило, желчных сферических паховой слива лимфатических узлов. Для поплитального слива лимфатических узлов урожая, по крайней мере 12 часов после инъекции, обездвижить мышь в положении склонны на акриловой стадии.
Нанесите минеральное масло на теленка и колено на инъекционной стороне животного. Затем сделайте разрез средней линии в теленка от пятки до колена, и отмежевать мускулатуру теленка от кожи. Разоблачить popliteal fossa.
Поплитальный лимфатический узел будет отображаться как полупрозрачная сфера в яме. Затем удалите лимфатический узел с помощью микрохирургии изогнутых типсов. Чтобы подготовить лимфатический узел для визуализации, поместите все органы в 35 на 10 миллиметров культуры блюдо со стеклянным дном, и использовать типсы, чтобы удалить любой жир, окружающий ткани.
Центр органа в середине блюдо, и покрыть ткань с куском солевого пропитанной деликатной задачи стеклоочистители. Для визуализации ex vivo распоистите блюдо в перевернутом слоте конфокального микроскопа и используйте обычный свет конфокального микроскопа и цель 4-10X, чтобы получить правильный фокус. Изменение от световой функции к лазерному режиму и использовать окрашенные изотопами, не окрашенные, или не флуоресцентные образца для регулировки лазерной мощности, смещения, и получить, чтобы удалить автоматическую флуоресценцию и любые неопределенные окрашивания.
Приобретайте изображения под целями 4, 10 и 20X, фокусируемые на структуре лимфатических узлов и клеточном распределении и используя определение пикселей 1024 к 1024. Затем используйте соответствующую программу анализа изображений, чтобы отделить каналы, добавить масштаб и цвета интереса, а также реконструировать 3D-вид. Мощное сочетание иммунолабеля клеток лимфатических узлов с антителами anti-CD4 и anti-CD19 и конфокальным анализом изображений позволяет локализовать Т и В-клетки в паховых лимфатических узлах.
В поплитальных лимфатических узлах, как и в паховой ткани, фолликулы В-клеток окружены популяциями Т-клеток, что является отличительной чертой структуры лимфатических узлов. Как отмечается в этих изображениях, фагоциты не интернализировать вводили антитела, что свидетельствует о том, что B и Т-клеток окрашивания является специфическим. Кроме того, реконструкция маркировки указывает на то, что окрашивание клеток Т и В не перекрывается, что еще больше подтверждает специфику окрашивания.
Моноклеточные клетки наблюдаются по всему паховой лимфатический узел, в том числе подкапсулярной пазухи. С большинством моноядерных ячеек, выражают CX3XR1, а затем CCR2 и CXCR31CCR2 двойные положительные клетки. Такая же картина распределения клеток и фенотипов клеток наблюдается в поплитальных лимфатических узлах.
Оба лимфатических узла также демонстрируют темные области без экспрессии моноядерных клеточных рецепторов, которые заняты лимфоцитами. Кроме того, моноядерные клетки не хватает во внутренней области лимфатических узлов, оставаясь сосредоточены во внешних областях ткани, что свидетельствует о том, что эти клетки в первую очередь занимают лимфатических узлов подкапсулярной пазухи. Смесь антитела должна быть точно введена в подкожной ткани для лимфатической системы правильно слить антитела к лимфатическому узлу.
Этот метод может быть применен к биораспределение флуоресцентных помеченных препаратов, а также к исследованиям клеток флуоресцентных помеченных наночастиц.
