Этот метод подготовки образцов разработан, чтобы объединить лучшее качество сохранения ультраструктуры с наиболее подходящим контрастом для модальности изображения в сфокусированном ионной балке сканирующего электронного микроскопа. Этот протокол особенно полезен для образцов, которые требуют подготовки при замораживании высокого давления для надежного сохранения ультраструктуры, но не получают достаточного контраста во время замены замораживания объемной визуализации. Для минимального встраивания смолы важно удалить как можно больше смолы, чтобы обеспечить надлежащее таргетинга позже в сфокусированном ионной балке сканирующего электронного микроскопа.
Для начала используйте пипетки, чтобы капать одну каплю 20%PVP PBS на режущей коврик. Погрузите в каплю расчлененный nervus tibialis. Используйте скальпель, чтобы сократить длину в два миллиметра образца.
Используйте тонкие типсы, чтобы поместить образец в 0,2 миллиметра глубиной типа А металлический образец перевозчика. Перенесите носитель в среднюю пластину картриджа. Поместите гексадекан покрытием типа B перевозчика на верхней в качестве крышки.
Закройте сборку, опустив верхнюю половину картриджа. Закройте картридж из трех частей в погрузочной станции морозильной камеры высокого давления. Нажмите кнопку процесса и продолжайте в соответствии с инструкциями производителя по эксплуатации.
В ванне с жидким азотом поместите образцы носителей в крио-флаконы, содержащие два миллилитра замороженной 0,1%-ного таниновой кислоты и ацетона, и закройте колпачки. Поместите флаконы крио в блок замены замораживания при температуре минус 90 градусов по Цельсию. Запустите программу и держите образцы там в течение 100 часов.
В блоке замены замораживания трижды в течение 30 минут промывают образцы двумя миллилитров ацетона. Поместите 2%osmium тетроксида в 0,1%уранил ацетат в блок замораживания замены для охлаждения и добавить его в образцы в течение семи часов продолжает окрашивание при минус 90 градусов по Цельсию. Когда температура программы в блоке замены замораживания достигает минус 20 градусов по Цельсию, держите образцы там еще 16 часов.
Когда температура поднимется до 4 градусов по Цельсию, отбросьте жидкость во флаконах и заполните чистый ацетон. Удалите крио флаконы из блок замены замораживания. Обработка образцов перед замораживанием и после осмофификации имеет решающее значение, так как образец может быть серьезно поврежден.
В дымовой капот, использовать тонкие типсы, чтобы удалить металлические носители из флаконов крио и передачи образцов от носителей, чтобы подзарядить их в 150 миллиметров глубоко смотреть стеклянную тарелку заполнены ацетоном. Используйте тонкие типсы для передачи образцов в две миллилитровые реакционной трубки, наполненные ацетоном. Установите микроволновую печь на 250 Вт в течение 40 секунд и начать микроволновую печь, чтобы мыть образцы и повторить четыре раза.
Pipette один миллилитр 1%thiocarbohydrazide раствор в реакционной трубке и положить его в микроволновую печь. Включите вакуумную функцию с двумя минутами и двумя минутами, итерируя в общей сложности 14 минут и установите ее на 150 Вт. Запустите микроволновую печь.
Вымойте образец четыре раза в ацетон, как и раньше. Pipette один миллилитр 2%osmium тетроксид раствор в реакционной трубке. Поместите образец в микроволновую печь и используйте те же микроволновые настройки, что и с тиокарбогидразидом.
Вымойте образец четыре раза в ацетон, как и раньше. Пипетт один миллилитр 25%смолы в ацетоне в реакционной трубке и положить его в микроволновую печь. Включите вакуумную функцию в течение трех минут и установите ее на 250 Вт.
Запустите микроволновую печь. Используйте зубочистку, чтобы удалить нервную голени из реакционной трубки и поместить их на кусок пластиковой пленки. Поместите галогенную лампу рядом с образцами для нагрева смолы.
Используя зубочистку, аккуратно нажмите образец вокруг на пластиковой пленке, пока не будет обнаружена оставшаяся смола. Положите пластиковую пленку с образцом сверху в духовку и установите температуру на 60 градусов по Цельсию, чтобы полимеризировать образцы, по крайней мере 48 часов. Используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать полимеризованные образцы вместе с пластиковой пленкой размером, подходящим для заглушки SEM.
Используйте зубочистку, чтобы добавить проводящие смолы серебра на SEM заглушки и прикрепить разрез образцов к нему. А затем добавить смолы вокруг образцов. Положите SEM заглушки в духовку для полимеризации при температуре 60 градусов по Цельсию, по крайней мере 4 часа или на ночь.
После полимеризации, положение SEM заглушки в распылитель. Установите распылитель на 35 миллиампер и нанесите 10 нанометров толщиной золотое покрытие или пальто в течение одной минуты. После покрытия поместите заглушки SEM внутри сфокусированного ионной балки сканирующего электронного микроскопа.
В этом исследовании, расширенный протокол был выполнен для nervus tibialis мыши, а также C.elegans, чтобы проиллюстрировать оптимальное сохранение и контраст для выполнения 3D объем изображения с сфокусированным ионным лучом сканирования электронного микроскопа. Стандартные протоколы часто страдают от отсутствия контраста мембран, где, как расширенный протокол обеспечивает сильный контраст мембраны. Поперечные изображения C.elegans с улучшенным протоколом и стандартным протоколом показывают отличительную разницу.
Как и для поперечных изображений nervus tibialis, расширенный протокол помогает показать более сильный контраст мембраны по сравнению со стандартным протоколом. После постобработки данные электронного микроскопа визуализируются с помощью IMOD, программы обработки изображений и моделирования. Область синего выделений показывает сегментированные аксоны.
На красной выделенной области показаны пучки Remak. Области с желтым и оранжевым выделением показывают миелиновые оболочки. А в бирюзовом районе показаны митохондрии.
Виртуальная нарезка и трехмерная модель иллюстрируют архитектуру тонкой ткани и помогают понять ее функцию. Можно использовать и другие методы сканирования электронов, такие как серийная блок-лицевая сканирующая электронная микроскопия и томография массива. Этот протокол также может быть использован для передачи электронной микроскопии и других типов образцов, таких как образцы из центральной нервной системы.
Осмий тетроксид, тиокарбогидрозид и ацетат уранила являются токсичными химическими веществами и должны использоваться тщательно. Смола также вредна и должна использоваться с осторожностью. Личное защитное оборудование, такое как перчатки и лабораторное пальто, следует носить для полного протокола.
