Наш комбинированный подход помогает ответить, как меняются параметры ультраструктурной нейропластичности после ранних вмешательств в развитие зарождающейся нервной системы в утробе матери. Основным преимуществом нашего метода является получение изображений с высоким разрешением макромезоми-микро- и наноструктур в предопределенной системе координат в атласе тканей. Смысл нашего метода заключается в его переводе терапевтического потенциала для врожденных нейродегенеративных заболеваний.
Например, лечение и спасение на эмбриональных стадиях с использованием этого метода трансдукции матки. Наш метод может быть применен к любой другой модели. Например, вид мыши может быть изменен, а также область интереса.
Исследователи, впервые пробуя наш метод, нуждаются в глубокой хирургической подготовке, а также в знании того, как подготовить ткань к электронной микроскопической визуализации. Начните с загрузки индивидуальный кончик капилляров, содержащий четыре раза от 10 до 11 вирусных частиц адено-ассоциированного вирусного типа 1 покрытия для желаемой цели, и помечены быстрым зеленым красителем на аспиратор трубки. Добавьте в капилляр 15 микролитров помеченных адено-ассоциированных вирусных частиц.
Далее, подтвердить отсутствие реакции на боль в крайнем случае в анестезированной эмбриональной день 14,5 беременной мыши, и дезинфицировать кожу. Используйте изогнутые зубчатые тибры радужной оболочки глаза и прямые ножницы карбида вольфрама, чтобы сделать разрез кожи вдоль линии mediana. Используя прямые пинцет Dumont для захвата брюшной стенки, продолжайте вдоль линии Альба с прямыми ножницами Vannas и поместите кусок фенестированных парафиновой пленки над брюшным отверстием и используйте ложку, как устройство, чтобы разоблачить рога матки, не повреждая эмбрионы внутри рога.
После нанесения нескольких капель 37-градусного-Цельсия PBS на рога матки, проверить эмбрионы на повреждение или пороки развития внутри матки мешок. Включите эмбрионы тщательно внутри их мешков, пока желаемое положение для каждой инъекции не будет достигнуто. Когда эмбрионы находятся на месте, введать от одного до двух микролитров быстрого зеленого помечены раствор частицы вируса в каждом эмбрионе.
После того, как все эмбрионы были введены, поместите рога матки обратно в брюшную полость, и добавить несколько капель 37-градусный-Celsius PBS в живот. Затем используйте полиамид 6-0 размера швы, чтобы закрыть брюшной стенки и полиамида 3-0 размера швов и комаров halsted в гемостатические миппы, чтобы закрыть кожу. Для встраивания изолированных тканей, представляющих интерес для теле-макросъемки, поместите образец ткани в специальную рамку с воспроизводимым углом сечения и зарегионировать координаты.
Заполните раму 30-градусной по Цельсию 3%agarose до тех пор, пока ткань покрыта, и покрыть раму пластиковой крышкой, пока агароза не затвердеет. В то время как агароза затвердевает, используйте теле-макро графическое устройство для изображения встроенной ткани и ее координат в кадре. Когда агароза затвердеет, перенесите в раму ткани, встроенные в агарозу, с режут зазорами, соответствующими координатам первого кадра.
Используйте устройство с тонким и вибрирующим лезвием бритвы, чтобы разрезать встроенную ткань на участки соответствующей экспериментальной толщины. Затем изображение каждого раздела ткани в PBS, и собирать изображения в папку. Для подготовки образцов тканей для передачи электронной микроскопии, в кабинете биобезопасности, мыть ткани разделов с двумя 30-минутные моет в PBS, а затем два часа инкубации в 2%aqueous осмия тетроксида раствор при комнатной температуре.
В конце инкубации, мыть осмикированных разделов еще два раза в PBS в течение 30 минут за стирку и обезвоживать разделы в последовательных 10-15-минутных погружений этанола, как указано. После погружения 70%ethanol, поместите каждый образец в черное блюдо на тусклом черном фоне и изображение образцов в 70%этанола под светодиодным светом RGB применяется к образцам с левой и правой сторон под углом 45 градусов. Создайте атлас изображений раздела с координатами, собирая изображения образцов серии в папке.
Лечить образцы с двумя 30-минутными 100%этанол инкубации, а затем два 30-минутных 100% инкубации оксида пропилена, как при комнатной температуре. В то время как образцы инкубируются, смешайте свежеприготовленную смолу с оксидом пропилена в соотношении один к одному и одному и двум, и добавьте 3%-ный ускоритель к обоим решениям. После второй инкубации оксида пропилена, перенесите образцы в один-два оксида пропилена смолы, встраивая средний раствор в течение двух часов при комнатной температуре, а затем двухчасовую инкубацию в один-к-одному оксид пропилена смолы, встраивающий средний раствор при комнатной температуре.
В конце второй инкубации перенесите ткани в плоские полипропиленовые блюда и излечим встроенные ткани свежей смолой, содержащей 3%-ю ускоритель в течение 12-24 часов при 65-85 градусах Цельсия. Затем охладить ткань до комнатной температуры и удалить смолы встроенных образцов из полипропиленовых блюд. Чтобы сопоставить область, интересную, выберите изображение, содержащее область интереса, из ранее подготовленного атласа изображений.
Эскиз границ области интереса на раздельное изображение, оптически наложить эти границы на встроенный образец под микроскопом, и использовать один дюйм 26 калибровочной иглы, чтобы поцарапать эти границы области на образец смолы. Затем нагрейте образцы до 95 градусов по Цельсию, чтобы смягчить смолу. Затем выведите из духовки образцы теплой смолы и используйте лезвие бритвы, чтобы подакцизные области, представляющие интерес.
Клей образцов на акриловое стекло проведения баров соответствующего калибра, и обрезать установленные образцы для полу-и ультра-тонких секций. Используйте ультрамикротом для приобретения полутонких 0,7-микрометровых и сверхтонких 70-нанометровых секций, собирая полутонкие секции на стеклянных носителях, а также сверхтонкие секции на никелевых сетках. Пятно полутонких секций с 1%Toluidine синий в PBS в течение четырех минут, а затем несколько моет в деионизированной воде, прежде чем изучать разделы с помощью световой микроскопии.
Ультратонкие секции могут быть непосредственно оценены по электронной микроскопии передачи на 180 киловольт без дальнейших изменений. После раздела, ткани ломтики изображены теле-макро фотографии, как только что продемонстрировано. После осмикации и погружения этанола, разделы изображены снова помехи света теле-макрографии, выявление специально цветной узор для каждой поверхности ткани.
После дополнительного обезвоживания и встраивания смолы области, представляющие интерес, отбираются и далее обрабатываются для передачи электронной микроскопии. В гиппокампе и мозжечках, мшистые волокна синапсы, как известно, демонстрируют уникальные ультраструктурные характеристики по сравнению с другими синапсами, в том числе большие пресинаптические бутоны. В своих поперечных профилях, бутоны содержат огромное количество пузырьков и митохондрий, и очень часто заключают несколько дендритных шипов.
В спинном мозге, спинной funiculus содержит много аксональных волокон, которые миелины олигодендроглии. На поперечных участках спинной funiculus можно найти между обоими задними рогами спинного мозга. На изображениях электронной микроскопии передачи, поперечные миелинированные аксоны появляются круглые, и миелиновые оболочки, окружающие аксоны, организованы в ламелле.
Подготовленный атлас и микрографические изображения электронной микроскопии передачи ультраструктурных параметров полезны не только для сравнения морфологической нейропластичности различных секций при различных условиях лечения, но и для сравнения параметров в пределах одной области. Не забудьте тщательно спланировать и подготовить перед началом в утробе матери трансдукции, и не забудьте иметь резервную копию материалов и инструментов в случае осложнений. Следуя нашему методу, могут быть добавлены другие методы, такие как маркировка иммуногольдов до электронной микроскопии для ультраструктурного отслеживания определенной молекулы интереса.
Начиная с целостного взгляда на весь организм и масштабирования в направлении молекулярной топографии, мы можем изучать и манипулировать связь между функцией тканей и морфологии. Осмий тетроксид опасен. Обязательно всегда работать под капотом, а также носить защитные очки и ручные перчатки при работе с этим реагентом.
