Наш протокол позволяет исследователям изолировать биологически активные сигнальные молекулы, используемые рептилиями в химической связи. А также разделение и очистка этих соединений для дополнительного тестирования, или даже идентификации. Используя этот метод, исследователи могут получить источник химических сигналов, а затем извлечь их для их количественной оценки или биоанализа использования в изоляции.
Демонстрация процедуры сегодня будет Холли Ракер, отличием диссертации студент из моей лаборатории. Начните с размещения пятисантиметровой квадратной части в герметичный стеклянный контейнер с шестиугольной совместимой крышкой и добавив достаточное количество шестиугольного в контейнер, чтобы полностью погрузить части кожи сарая перед уплотнением контейнера. На следующий день, использовать чистые металлические типсы, чтобы удалить части сарая, встряхивая куски, как они захвачены, чтобы сохранить все оставшиеся шестиугольный в контейнере.
Для определения извлеченной липидной массы перенесите экстракт на предварительно взвешенную круглую нижнюю колбу и включите вакуумный источник к ротору испарителя, убедившись, что вакуумного давления достаточно, чтобы держать колбу на шее конденсатора. Откройте вентиляцию в конце конденсатор, сдвиньте колбу на шею конденсатор и закройте вентиляцию, чтобы запечатать систему. После того, как убедиться, что колба не может отключиться от конденсатор, когда колба выпущена.
Опустите колбу до тех пор, пока только нижние 10% колбы не коснется воды в ванне, и начните вращение со средней скоростью. Если вакуум, скорость, конденсаторный поток и температура ванны являются оптимальными, растворитель пара, оставляя колбу будет конденсироваться на катушке и капать в колбу восстановления. Испарите образец под вакуумом до тех пор, пока в нижней части колбы не будет виден шарик жидкости диаметром менее одного сантиметра.
Затем выключите вращение и вакуум, и поднять колбу из ванны. Держите шею колбы, как вакуумный уплотнитель освобожден, и крутить шею в сторону колбы от конденсатор. Шарик жидкости в экстракте будет затвердевать, как шестиугольный испаряется.
После того, как шарик высохнет при комнатной температуре около пяти минут, липиды образуют полупрозрачный белый и желтый воск в колбе. Взвесить колбу, чтобы получить окончательную массу и solubilize липидов в записанном объеме шестиугольника, чтобы дать один миллиграмм или более липидов на один миллилитр шестиугольника. Чтобы подготовить колонку хроматографии, используйте деревянный дюбельный стержень, длиннее колонны, чтобы расположить квадрат из четырех на четыре сантиметра сложенного стекловолокна на дне стеклянной хроматографии.
Закрепт колонну в дымовом капюшоне до стандартного кольца и откройте стопкок. Затем, залить промытый и сушеный песок в колонку, пока примерно три сантиметра песка лежит над стекловолокном. Затем поместите темную бумагу под колонку и осторожно коснитесь ее.
Теперь поместите 500 миллилитров стакан под колонку и медленно мокрый песок с примерно 25 миллилитров шестиугольника, закрытие стопкок, когда есть примерно 0,5 сантиметров шестиугольника над песком. Чтобы активировать нейтральную иллюмина, пипетка деионизировала воду объемом, равным 6% массы илюмина в каплях по всей илюмине. И накройте колбу активированной илюминой, энергично закрученной раствор, чтобы равномерно разогнать заряд.
Когда видимых скопленийилляны не останется, добавьте гексана до тех пор, пока илюмина полностью не будет покрыта около 0,5 сантиметрами шестиугольного. Закружить колбу, чтобы сформировать суспензию, и поместите новый 500 миллилитров стеклянный стакан под колонной. Откройте стопкок, затем закружить illumina снова, прежде чем неуклонно заливки илюмина в вентилируемой воронки, состоявшейся в резервуаре колонны, заботясь о том, что illumina оседает равномерно в колонне и что нет больших пузырьков или трещин форме.
Колонна образуется, когда верхняя часть илюмина стабильна и примерно на четыре сантиметра ниже шеи колонны у основания водохранилища. Затем используйте пипетку, чтобы промыть внутреннюю часть резервуара гексаном для остаточного иллюмина, и аккуратно добавить второй слой песка поверхиллюмина примерно на один сантиметр ниже резервуара. Для фракционации липидного экстракта используйте длинный стеклянный пипетку для переноса образца липидов в колонку и медленно пипетки экстракта, чтобы избежать нарушений слой песка.
Промыть экстракт мерзким с пятью миллилитров шестиугольника и передачи мытья в колонке. Когда все выдержки были добавлены, откройте стопкок и позвольте образцу загрузиться в столбец. После добавления образца столбец должен оставаться насыщенным растворителем.
Если столбец высох, образец будет потерян. Поместите предварительно взвешенную и помеченную круглую нижнюю колбу под столбец, чтобы собрать первую фракцию. И используйте вентилируемую стеклянную воронку, чтобы залить 100%-процентный шестиугольный в сторону резервуара, чтобы не беспокоить слой песка.
Затем откройте стопкок, чтобы начать элюцию, закрыв стопкок, когда примерно три миллилитров шестиугольника остаются над песком в верхней части колонны. По мере того как более большие животные естественно производят больше липидов кожи из-за их большой общей площади поверхности кожи, важно стандартизировать извлеченную липидную массу к длине отверстия морды животного. Как только стандартизировано к полной массе кожи сарая, линейная связь извлеченной массы липидов кожи с массой извлеченной кожи сарая вполне извлекается.
После фракциотации один и тот же подход к стандартизации может использоваться с массами отдельных фракций. Например, здесь каждая фракция не вносит равного вклада в общую извлеченную липидную массу, так как нейтральные липиды являются доминирующим набором соединений по массе пропорции, по сравнению с каждым набором более полярных липидов. Если идентификация соединений является конечной целью, используйте чистую стеклянную посуду, и вы должны избегать пластмасс, чтобы предотвратить загрязнение образцов.
Для идентификации соединений после сбора образцов можно проводить жидко-газовую хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией. Кроме того, биоанализ может быть проведен для выяснения биоактивности образца.
