Для оценки эффективности и безопасности перспективных и новых подходов к генной терапии решающее значение имеет комплексное тестирование генно-модифицированных клеток в проверенных доклинтических моделях in vivo. Сохранение соответствующих маркеров поверхности клеток 'перекрестной реактивности реагентов, и способность применять те же вспомогательные методы лечения, вводимые пациентам вдоль нечеловеческих моделей приматов, чтобы тесно имитировать клинические параметры. Демонстрацией процедуры со мной будет Антай Перес, научный сотрудник лаборатории доктора Ханса-Петера Кима.
Начните с добавления от 10 до 12 миллилитров алицитов костного мозга, изолированных от здорового нечеловеческого донора приматов, в 50 миллилитров конических трубок. Довнесите объем трубки до 50 миллилитров с гемолитическим буфером и инкубировать клетки на срок до семи минут при комнатной температуре. Удалите клеточный мусор путем центрифугации, и аспирировать все, кроме последних двух-пяти миллилитров супернатанта.
Resuspend гранулы в остаточном сверхнатантного объема, стряхивая трубку, и передачи подвесок костного мозга в новую 50 миллилитровую трубку с помощью 70 микрометров поры клетки ситечко для удаления тромбов. Добавьте свежий гемолитический буфер, чтобы довести объем до 50 миллилитров, и инкубировать клетки в течение еще пяти минут при комнатной температуре перед их сбором центрифугации. Аспирировать все супернатанты и повторно помыть клетки в 10 миллилитров максимального буфера.
Перед фильтрацией клеточной подвески через еще 70 микрометровый поры ситечко, промыть трубку с 40 миллилитров свежего буфера, и бассейн мыть с клеточной подвеской. После обогащения для CD34 положительных клеток в соответствии со стандартными магнитными помощниками протоколов сортировки клеток, мыть бисер изолированных клеток до 50 миллилитров свежего буфера макс, и повторно использовать гранулы в HSPC среды. Затем пластины от 10 до 20 миллилитров клеток в вентилируемых тканей культурных лечение T75 колбы для их ночной культуры в 37 градусов по Цельсию и 5%углеродного диоксида инкубатора.
Для оценки до и после обогащения чистоты образцов клеток костного мозга создать протокол цитометрии потока с соответствующими участками и иерархии населения, показывающие все ворота для всех событий рассеяния, CD34 положительные, гематопоэтические стволовые клетки, мультипотентные ан-эритро миелоидных прародителей и лимфо миелоидных прародителей. Далее, запустить незапачканные, предварительно обогащения, белые кровяные клетки образца для регулировки напряжения для вперед и стороны рассеяния параметров, и все каналы флуоресценции следуют одного окрашенных шариков компенсации для регулировки компенсации между соседними каналами. Затем запустите все оставшиеся незапачканные и окрашенные образцы с скорректированным и компенсированным протоколом для документирования эффективности обогащения CD34.
Когда все компенсации были установлены настроить сортер клеток для сортировки рода CD34 подмножества в колонии формирования клеток анализы, и загрузить окрашенные CD34 обогащенной пробной трубки на цитометр. Затем завехать от 2000 до 3000 событий, и тонко настроить рода ворота, чтобы соответствовать силе сигнала и целевых групп населения. Когда установка завершена приобрести клетки корректировки скорости потока до 500 до 1000 клеток в секунду, и сортировки от 800 до 1200 клеток из рассеяния, CD34 положительные, гематопоэтические стволовые клетки, многопотентные эритро миелоидный предшественник и лимфо миелоидных ворот прародителя в отдельные трубки, содержащие 3,6 миллилитров колонии клеток формирования средней трубки.
В конце рода вихрь сбора труб, и добавить один миллилитр клеточной суспензии до трех стерильных 3,5 сантиметра, не-ткани культуры лечение Петри блюда, установленные в рамках отдельных 15 сантиметров Петри блюда на клеточной популяции для их 10-14 день инкубации при 37 градусов по Цельсию. На следующее утро используйте 10 миллилитровую пипетку, чтобы аккуратно промыть клетки-адепты со дна каждой колбы стерильным HBSS и собрать собранные клетки путем центрифугации. Resuspend клетки в среде трансдукции на 1 х 10 до 6 клеток на миллилитр концентрации.
И добавить один миллилитр клеток для макета управления в одном колодец рекомбинантного фрагмента фибронектина покрытием 12 хорошо пластины для ночной инкубации в инкубаторе культуры клеток. Затем добавьте 10 миллилитров алицитов оставшихся клеток в рекомбинантный фрагмент фибронектина, покрытый колбами T75 в течение 30 минут инкубации в инкубаторе клеточной культуры с вентилируемой крышкой. Во время инкубации вируса оттепели условные средние образцы и рассчитать количество вируса, который будет добавлен на основе титра и количество инфекционных единиц клеток на миллилитр.
Возьмите колбу из инкубатора и добавить соответствующий объем вируса обусловленной среде каждой колбы, прежде чем вернуть клетки до 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. На следующее утро перенесите клетки из колбы в отдельные 50 миллилитровые конические трубки. Вымойте клетки до 50 миллилитров HBSS за стирку, и повторить этот шаг до трех раз, чтобы удалить остаточный вирус.
Инкубировать клетки в течение двух часов в СРЕДСТВАх массовой информации HSPC дополнены простагландин E2. Затем промыть клетки и повторно помыть клетки в 10 миллилитров HBSS дополняется 2%аутологичной сыворотки на трубку. Затем аспирировать клеточные суспензии с помощью 20 миллилитров шприца оснащен 16,5 калибровочных игл. Вымойте внутреннюю часть трубки со свежим HBSS плюс 2%аутологичной сыворотки, и аспират в шприц.
Тщательно крышка шприц с иглой крышкой перед размещением клеточного раствора на льду до его вливания в аутологичный хост. Для определения эффективности генно-модификации трансвиндированных клеток пластина 1 х 10 к 6-й зарезервированной макет или транс индуцированных клеток на миллилитр среды HSPC на неткани культуры обработанных пластин. В дни два, пять и двенадцать после трансдукции, урожай и рассчитывать клетки.
В два и пять дней, replate 33% клеток в свежем HSPC среды на 1 х 10 до 6 на миллилитр концентрации. В дни два, пять и двенадцать, заморозить 33% клеток в буфере извлечения ДНК для количественного ПЦР в режиме реального времени, и проанализировать окончательные 33% клеток по потоку цитометрии в соответствии со стандартными протоколами для оценки фенотипического состава гематопоэтического потомства. Для количественной оценки экспрессии трансгена по цитометрии потока добавьте три дополнительных боковых рассеяния против.
трансгенные участки; и ворота первый участок на гематопоэтических стволовых клеток, второй участок на многопотентных ан-эритро миелоидных прародителей, и третий сюжет на лимфо миелоидных прародителей, все против трансгена. Затем завехать от 2000 до 3000 событий и тонко настроить ворота сортировки, чтобы соответствовать силе сигнала и целевых групп населения.
Используя этот протокол число нечеловеческих приматов CD34 положительные HSPC, которые обогащены, как правило, пропорциональны входной общей количество белых кровяных клеток. Как показали предыдущие выводы, что общий CD34 положительный продукт HSPC включает в себя клетки, которые не являются истинными долгосрочной перспективе и прививки гематопоэтических стволовых клеток, эти поток цитометрии на основе и колонии формирования клеточных методов могут быть использованы для надежного выявления и дифференциации подмножества обогащенных для долгосрочной перспективе гематопоэтических стволовых клеток от совершенных прародителей. CD34 положительные человеческие стволовые клетки обогащенные клетки могут быть эффективно модифицированы геном с помощью лентивирусных векторов.
Клетки, несущие неинтегрированную копию вектора, разбавляют в течение 12-дневного периода анализа жидкой культуры, в то время как стабилико интегрированные векторы в геноме передаются всем потомствам. Как подтверждается выражением вектора в колонии формирования клеток анализы. Этот доклинологический метод может быть использован для изоляции генетически модифицированных в качестве контролируемых нечеловеческих приматов гематопоэтических стволовых и прародителя клеток для генной терапии.
Этот метод может быть легко адаптирован для других видов, источников гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников, инструментов генной терапии и болезней. Этот тщательно проверенный протокол показывает большие перспективы для моделирования эффективных методов лечения многочисленных заболеваний человека. Имейте в виду, что работа с нечеловеческими тканями приматов требует усиленных мер безопасности, включая средства индивидуальной защиты.
