Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, о развитии биопленки, такие как, как определить ключевые условия окружающей среды, которые влияют на рост биопленки и поведенческие характеристики во время развития. Основным преимуществом этой техники является то, что многоканаленные, микрожидкие пластины, позволяют быстро обзадать статистически значимые результаты. Хотя этот метод может дать представление о структуре биопленки, он также может быть применен к изучению лечения антибиотиками, и биовосстановления.
Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что пристальное внимание к деталям протокола и дотошные навыки, необходимы. Чтобы избежать ошибки при подключении прибора к программному обеспечению, сначала включите рабочую станцию ПК, а затем модуль флуоресценции. Убедитесь, что флуоресценция затвора на, и включите аппаратные контроллеры.
Затем включите контроллер системы визуализации и камеру CCD. Затем включите станцию визуализации. Когда все оборудование будет готово, запустите контрольное приложение и введите номер, расположенный на этикетке на боковой стороне пластины.
Для грунтовки, сначала удалите 48 хорошо микро-жидкой пластины из упаковки, не касаясь стеклянной поверхности в нижней части пластины, и очистить стеклянную горку на дне пластины, с ткани объектива. Для подготовки микрожидких каналов, пипетки 200 микролитров 37 градусов по Цельсию минимальной среде в выход хорошо, заботясь, чтобы избежать пузырьков. Затем поместите пластину на сцену пластины.
Протрите интерфейс этанолом, запечатав его на сцене пластины, как только этанол высохнет. В ручном режиме на модуле управления установите жидкость, как бульон Лурия-Бертани при 37 градусах по Цельсию, и максимум как пять дым на квадратный сантиметр. Нажмите на выходные скважины, чтобы активировать поток от выхода к входной скважине, чтобы загрунтовать каналы.
Через пять минут приостановить поток, чтобы подготовиться к посевной, и тщательно удалить пластину со сцены. Затем аспирировать любую остаточную среду из вывода хорошо, не удаляя никакой среды из внутреннего круга, что приводит к микро-жидкостных каналов. Чтобы посеять экспериментальные каналы, добавьте 300 микролитров минимальной среды в входной колодец, а затем добавление 300 микролитров бактериальной культуры, в выход хорошо.
Верните пластину на этап изображения убедившись, что протрите интерфейс этанолом, прежде чем поместить его на тарелку, и использовать живой канал камеры, чтобы сосредоточиться на одном канале. При визуальном мониторинге живого корма, возобновить поток на 1 до 2 дым на квадратный сантиметр в течение примерно 2 до 4 секунд, чтобы клетки, чтобы войти в экспериментальный канал, но не серпантинные каналы, и оставить пластину на стадии контроля температуры в течение одного часа, чтобы клетки, чтобы прикрепить. В конце периода крепления, тщательно удалить пластину со сцены и аспирировать бактерии из выходных хорошо, не нарушая канал.
Затем используйте новый наконечник пипетки, чтобы удалить среду из входных скважин. В программном обеспечении откройте многомерное приобретение для управления получением изображения микроскопа и выберите промежуток времени, несколько этапных позиций и несколько длин волн. В вкладке сохранения, создать простое базовое имя, убедившись, что incroments базовое имя, если файл существует, проверяется.
Включите в описание любые существенные детали эксперимента. Нажмите выберите каталог, чтобы выбрать папку, в которой все файлы будут сохранены под вкладкой промежуток времени, настроить продолжительность экспериментального времени, до 24 часов, и установить интервал времени для получения изображений каждые пять минут в течение эксперимента. Используйте живой канал камеры и 10x цель установить положение сцены, сосредоточив внимание на центре канала, расположенный выше или ниже номера канала выгравированы на пластине.
Переключитесь на цель 20x и найдите оптимальную зону обзора и фокусную плоскость внутри канала. Затем добавьте положение этапа в список с новыми настройками. В меню длин волн установите количество длин волн до 3 и установите первую длину волны FITC 100%-камеры, с десятими миллисекундной экспозицией, второй длиной волны до яркого поля 50%камеры 50% видимой, с минимальным временем экспозиции 3 миллисекунды и третьей длиной волны до всех закрытых, так что свет не остается на последнем канале между временем приобретения.
В меню редактирования AutoRun откройте вкладку настройки протокола и установите новый протокол с 24-часовой продолжительностью с потоком, установленным в форвардном направлении при соответствующей экспериментальной скорости снопы. Нажмите добавить и сохранить, чтобы сохранить протокол и открыть вкладку настройки последовательности. Чтобы создать новую последовательность, выберите бульон Лурия-Бертани при 37 градусах, как жидкость по умолчанию для всех каналов.
В соответствии с этапом итерации 1 для каналов 1 до 12, выберите протокол с первой экспериментальной скоростью стрижки и включите все каналы. Для каналов с 13 по 24 выберите протокол со второй экспериментальной скоростью снора и включите все каналы. Затем выберите Apply and Save As, чтобы сохранить последовательность и откройте меню AutoRun, чтобы выбрать сохраненную последовательность, которая будет использоваться для AutoRun.
Чтобы настроить эксперимент по биопленки при росте, добавьте до 1300 микролитров стерильной минимальной среды в входной колодец микрожидкой пластины и верните пластину на стадию визуализации. Затем протрите интерфейс этанолом и загерметив тарелку. Подтвердите правильное настройку протоколов и последовательностей.
Выберите старт, чтобы начать AutoRun, и сразу же нажмите приобрести, чтобы начать сбор изображений микроскопа. В конце первого приобретения изображения нажмите паузу и выберите режим живого изображения в длине волны яркого поля. Выберите перейдите для просмотра каждой позиции этапа и выберите набор для текущего, чтобы установить новые настройки.
Затем нажмите резюме, прежде чем начать следующее запланированное приобретение. В этом репрезентативном эксперименте по росту биопленки покрытие биопленки, или процентная пороговая площадь поверхности, отличалось для всех трех параметров стрижки, что указывает на то, что слэйр оказал непосредственное влияние на покрытие поверхности биопленки. Общее относительное измерение накопления биопленки, увеличено как функция времени, при темпы роста склоняясь от самого высокого напряжения стрижки к самому низкому стрессу стрижки.
При каждом условии существует также четкий период экспоненциального роста, на основе которого можно рассчитать количественные темпы роста. В целом коэффициент шероховатости со временем снижался при всех условиях стрижки, что свидетельствует о том, что все поверхности биопленки стали более гладкими. Однако, по сравнению с самым низким сливом, более высокие параметры слэра привели к более гладкой поверхности с течением времени, что указывает на то, что более быстрый поток стрижки способствует более гладкой и равномерной поверхности.
Кроме того, текстурная энтропия, или случайность в морфологии, увеличилась с течением времени для всех условий стрижки. При выполнении этой процедуры важно помнить, чтобы следовать указанной последовательности и взять время, чтобы выполнить каждый шаг точно. Необходимые навыки могут занять несколько работает освоить.
После этой процедуры, другие методы, такие как HBLC или GCMS, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о концентрациях подстроек, таких как глюкоза, потребляется. После его развития, этот метод проложил путь для исследователей в области биопленок для изучения общих условий потока в режиме реального времени с контролируемыми экспериментальными условиями и гидротерапии выборки. Не забывайте, что работа с бактериальными штаммами BSL2 может быть чрезвычайно опасной, и что такие меры предосторожности, как ношение надлежащего защитного оборудования и использование соответствующих протоколов отходов, всегда должны приниматься при выполнении этой процедуры.
