Данный протокол позволяет изготовлять нити объемной внеклеточной матрицы из культурных клеточных линий, что позволяет проводить исследования в области клеточных матричных взаимодействий, а также исследовать потенциал этого биоматериала для восстановления ран. Эти синтетические волокна могут избежать реакции ино иностранного тела, направленной против синтетических материалов, в то же время опираясь на богатый репертуар текстильных методов изготовления для создания широкого спектра тканых имплантируемых. Демонстрацией процедуры будет Кассандра Рид, аспирант из моей лаборатории.
Перед посевом клеток, автоклав полых мембран волокна при 121 градусов по Цельсию в течение 30 минут, а затем лечение 50 миллилитров фибронектина плазмы крупного рогатого скота в PBS при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа в течение одного часа. В конце инкубации используйте стерильные микро ножницы, чтобы сократить волокна до шести сантиметров или меньше, и использовать один миллилитр шприц оснащен 21 калибровочных игл для семян один раз от 10 до пятого фибробластов клетки непосредственно в lumina полых мембран волокна. Поместите шесть семенных волокон в шестидюймовый диаметр чашки Петри, и кратко инкубировать семенами волокон при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа.
Через пять минут перенесите волокна из инкубатора в новую шестимиметровую чашку Петри, содержащую фибробластовую культурную среду, дополненную L-аскорбиновой кислотой, L-аскорбиновой кислотой 2 фосфата, и трансформирует фактор роста бета 1 на срок до трех недель в инкубаторе клеточной культуры. В конце инкубации, использовать типсы o передачи культурных волокон в отдельные сцинтилляционные флаконы, и наклонить каждый флакон, чтобы добавление до пяти миллилитров N-Метил-2-пирролидон вниз стороне флаконов. Затем используйте серологическую пипетку, чтобы медленно аспирировать N-метил-2-пирролидон из каждого волокна, и передать волокна в новые флаконы сцинтилляции для второго погружения в свежий N-метил-2-пирролидон.
После третьего погружения, промыть в результате внеклеточной матрицы нити три раза в деионизированной воде аналогичным образом, и место три дюйма длиной, один дюйм в ширину 1/23-дюймовый толщиной кусок силиконовой резины с центральной восемь на четыре миллиметра прямоугольной формы на стандартные три на один дюймовый стеклянный микроскоп слайд. После автоклавирования, положите каждое внеклеточное матричное волокно бок о бок в восьми на четыре миллиметра силиконовой формы, пока нет видимого открытого пространства. Поместите плесень в 50 миллилитров конической трубки, и заморозить волокна при отрицательном 80 градусов по Цельсию, пока полностью заморожены.
Для децеллюляризации инкубировать плесень в 1% додекилового сульфата натрия в течение 24 часов при комнатной температуре на рокере с нежным возбуждением. На следующий день, промыть извлеченные внеклеточной матрицы с тремя моет в три миллилитров PBS за стирку, и заполнить плесень со свежеприготовленными ДНК / РНК реактора пищеварения в течение шести часов инкубации при четырех градусах по Цельсию. В конце пищеварения, аспирировать раствор пищеварения и промыть плесень три раза в стерильных PBS, как попродемонстрировано.
После третьей стирки, инкубировать леса в 10%Пенициллин-Стрептомицин в PBS при четырех градусах по Цельсию ночь перед замораживанием в 50 миллилитров конической трубки при отрицательном 80 градусов по Цельсию в течение примерно одного часа. Когда сетка полностью заморожена, лиофилизируют децеллюляризованную внеклеточную сетку на ночь или до полного высыхания и передают лиофилизированные леса в стерильный контейнер в пределах био-защитного капота и хранят при четырех градусах Цельсия до их использования. Здесь показан поперечное сечение полисульфонной полой оптоволоконной мембраны, изготовленной с помощью этого протокола, с помощью внешних и внутренних слоев пальцев, как поры, характерные для асимметричной мембраны.
После фибробластового посева клеток и культуры, N-Метил-2-пирролидон полоскания, как попродемонстрировано, полупрозрачные нити внеклеточной матрицы производятся. Внеклеточная матрица, производящая клетки, остается жизнеспособной внутри полых волоконных мембран в течение всего периода культуры в течение всей трех недель. Извлеченная матрица имеет полупрозрачный вид при гидратации, экспонирование небелого цвета и волокнистого внешнего вида с грубым продольным выравниванием при сборке сетки и лиофилии.
Наиболее важным шагом является процесс растворения культурных полых волоконных мембран в растворителя N-Метил-2-пирролидон для извлечения внеклеточной матрицы. Материал, производимый этим методом, может быть использован для изготовления тканевых имплантатов для исследования восстановления тканей в доклинических исследованиях. N-Метил-2-пирролидон, используемый в этом протоколе, является раздражающим фактором кожи и глаз, и поэтому рекомендуется обращаться с химическим веществом с помощью нитриловых перчаток, очков, лабораторного пальто и обрабатывать его в дымовом капюшоне.
