Этот метод может помочь понять ключевые вопросы в области миграции иммунных клеток, такие как, как цитоскелет посылает силы стрижки и как интегрин лиганды и хемокины влияют на поток индуцированной миграции лейкоцитов. Основным преимуществом этой техники является то, что это новый тип миграции анализ, который легко для начинающих для выполнения. Он использует только коммерчески доступное оборудование и реагенты, а также свободные программы.
Хотя этот метод может дать представление о маргинальных клетках зоны В, он также может быть применен к другим иммунным клеткам, таким как активированные Т-клетки. За день до эксперимента оттаивать алицит ICAM-1 и разбавлять его в PBS до конечной концентрации в пять микрограмм на миллилитр. Затем добавьте 30 микролитров ICAM-1 в нужные камеры слайда потока.
Поместите слайд во влажную камеру, и установить его на четыре градуса по Цельсию, чтобы инкубировать на ночь. На следующий день, мыть камеру, добавив 100 микролитров PBS к одному хорошо, а затем снятия 100 микролитров из другой колодец камеры. Затем добавьте 100 микролитров блокирующего буфера в камеру и инкубировать горку во влажной камере при комнатной температуре в течение 90 минут.
Затем вымойте камеру, добавив 100 микролитров PBS к одной колодец, вытесив ее из другой хорошо, а затем добавить 100 микролитров буфера миграции в камеру. Слайд теперь готов к использованию. Храните его во влажной камере при комнатной температуре до начала эксперимента.
Во-первых, подключите жидкий насос и прикрепите блок жидкости. Затем включите программное обеспечение насоса. Затем вымойте трубку один раз с помощью 5-10 миллилитров буфера миграции.
Это займет около одной минуты. Затем добавьте 11,7 миллилитров буфера миграции в равной степени к обоим резервуарам и удалите пузырьки воздуха. Теперь зажимать трубки около 10 сантиметров от разъема кусок, и место жидкостного блока в нагретой инкубационой камеры на микроскоп.
В программном обеспечении установите выбор слайда для микроскользя VI 0.4 и опцию трубки до белого цвета. Кроме того, установить желаемый стресс снора около четырех динов на квадратный сантиметр и время изображения до 30 минут. Затем установите желаемую скорость потока и нагрузку на стрижку, введя значения в программное обеспечение насоса.
Далее, предварительно разогреть инкубационую камеру микроскопа, блок жидкости и буфер миграции aliquots до 37 градусов по Цельсию. После нагрева, проверить жидкий насос, гарантируя, что буфер миграции течет вперед и назад в резервуарах и что Есть нет пузырьков воздуха в системе. Во-первых, изолировать лейкоциты и очистить маргинальные клетки зоны В, как описано в сопроводительном текстовом протоколе.
Затем очистите дно горки этанолом. Добавьте 30 микролитров подвески ячейки в один колодец камеры и вывяйте 30 микролитров сохраненного буфера миграции из другой системы. Обложка слайд, и инкубировать его в течение 30 минут, чтобы клетки, чтобы прикрепить.
Затем медленно добавляйте предварительно разогретый буфер миграции к каждому колодецу слайда до тех пор, пока положительный мениск не поднимется из колодеца. Удалите любые пузырьки воздуха кончиком пипетки. Важно поддерживать согласованность с факторами, влияющими на адгезию клеток, поэтому держите буферы и ячейки на 37 градусов, и избегайте использования чрезмерной силы при трубопроводе буфера в камеру.
Зажим слайд на стадии микроскопа, и удалить немаркированные стороны жидкостных труб из разъема кусок. Затем заполните конец трубки миграционным буфером до тех пор, пока положительный мениск без пузырьков воздуха не поднимется из конца. Переверните конец трубки, и вставьте его в верхней хорошо потока камеры.
Сохраняя зажатые трубки, повторите процедуру для отмеченного конца трубки. Теперь переключитесь систему визуализации в режим Live и выберите поле зрения, на которое находится середина слайда. Здесь, установить акцент на клетки, а затем слегка де-фокус для повышения черного контура клеток и производить белый интерьер.
Черный фон и белый центр будет проще в использовании в автоматизированной программе слежения. Настройка программы последовательности изображений для записи одного изображения каждые пять секунд в течение 30 минут с использованием 10x сухой цели. Затем начните запись.
Снимите зажим с трубки и включите насос. Это приведет к тому, что клетки, не являющиеся адептами, смываются, а клетки-адепты начинают мигрировать. В конце программы визуализации отклеить и сохранить фильм.
При использовании ингибитора или модификатора миграции клеток его можно добавить либо к клеткам в клеточной подвеске, прежде чем положить их на слайд, либо к буферу миграции в блоке жидкости. Чтобы начать автоматический анализ пути миграции, откройте программу ImageJ. Скопировать MTrack2_kt Java в папку ImageJ Plugins.
В меню Plugins выберите компиляцию и запуск. Затем перезапустите ImageJ, и плагин должен появиться в меню Plugins. Откройте стек изображений из фильма миграции ячеек в ImageJ и обработать изображения, показанные здесь, чтобы преобразовать видео из цветных кадров в высококонтрастные изображения, показывающие ячейки как черные объекты на белом фоне.
Затем заточить изображения в два раза, despeckle изображения, а затем преобразовать изображения в восемь бит. В меню Изображения перейдите в подменю Adjust Brightness/Contrast и поместите слайдер Contrast на максимальный контраст. Это сделает клетки отображаться в качестве белых объектов на черном фоне.
Затем вернитесь к подмене порога регулировки, чтобы убедиться, что ячейки отображаются в качестве черных объектов на белом фоне. Теперь запустите автоматический плагин отслеживания ячеек MTrack2 kt. На экране опций установите минимальный размер частицы до одного пикселя и максимальный размер частицы до 30 пикселей.
Установите значение скорости до 10 пикселей, хотя маргинальные ячейки зоны В, как правило, не превышают двух пикселей на последовательных кадрах, которые находятся на пять секунд друг от друга. Сотовые треки теперь готовы к анализу с помощью инструмента ibidi Chemotaxis. Эти два поля показывают пути миграции маргинальных ячеек зоны В, которые были посеяны на слайдах с покрытием ICAM-1.
Клетки отслеживались автоматически с помощью MTrack2 с использованием методов, описанных в этой статье. Слева клетки были изображены в статических условиях, а на правых клетках были подвержены потоку слайра из четырех гинов на квадратный сантиметр. Отдельные клеточные треки могут быть импортированы в инструмент ibidi Chemotaxis для создания трековых сюжетов каждого фильма.
Здесь отдельные клеточные треки окрашены в красный цвет, чтобы указать, что они закончили вниз по течению от точки их происхождения или черный, если они оказались вверх по течению. Здесь показан анализ клеточных треков из четырех отдельных фильмов как для потока, так и для условий потока. Это включает в себя средний индекс направленной миграции, скорость ячейки, прямоту пути и окончательное расстояние прямой линии для обоих условий.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как изображение направленной миграции маргинальных ячеек зоны B к потоку сала и как автоматически отслеживать клетки. Во время этой процедуры, другие методы, такие как микроскопия TIRF могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как, как цитоскелет и интегрины реагировать на стресс стрижки?
