Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии, такие как понимание изменения экспрессии генов в тысячах одиночных клеток после травмы или болезни. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет нам вскрывать транскриптомы отдельных клеток в сложной ткани, а также лучше оценить функциональную динамику в данной популяции. Преимущество нашего протокола заключается в том, что он предоставляет комплексные методы, от изоляции одиночных клеток в первичных тканях до анализа и визуализации этого набора данных.
Хотя этот метод начинается с одноклеточных суспензий от кожи и нерва, методы секвенирования, которые мы описываем, могут быть применены для изучения любой ткани млекопитающих. Демонстрацией этой процедуры будут Элоди Лабит и Вису Шин, два стажера из моей лаборатории. Для начала, вскрыть седалищный нерв усыпанной мыши, сначала отрезав кожу от задней области задней части мыши.
Используйте стерильное лезвие скальпеля, чтобы сделать разрез по длине бедра. Затем используйте тонкие типсы и ножницы, чтобы разоблачить и удалить седалищный нерв. Чтобы вскрыть спинную кожу спины, используйте тонкие миппы и ножницы, чтобы сделать разрезы с плеча на плечо, через колею, и вниз по спине.
Вымойте ткани дважды с ледяной HBSS. Под рассеченным микроскопом удалите нежелательные соединительной ткани, жировые отложения или мусор. Только для кожи нарежьте кожу тонкими ломтиками, используя стерильное лезвие скальпеля.
Чтобы получить кожу дермы, плавать ломтики кожи в dispase, в HBSS в 10 сантиметров блюдо, в течение 30 до 40 минут при 37 градусов по Цельсию. Используйте тонкие типсы, чтобы очистить и отделить эпидермис от дермы, а затем отказаться от эпидермиса. Затем, для кожи и нерва, используйте пару стерильных лезвий скальпеля, чтобы измельчить каждый образец на один-два миллиметра штук.
Поместите кусочки ткани в свежеоттая, два грамма на миллилитр холодного коллагеназы четыре фермента в 15 миллилитров конической трубки. Инкубировать каждый образец фермента в 37-градусной ванне по Цельсию в течение 30 минут с нежной тряской каждые 10 минут. На 30 минут, использовать P1000 pipetter тритурировать ткани 20 до 30 раз, и вернуться к водяной бане.
Повторяйте тритурацию каждые 30 минут, пока раствор не появится облачным, и куски ткани в значительной степени разобщены. Только для кожи, в последний час инкубации, добавить один миллиграмм на миллилитр DNAse в образец кожи. В виду того что некоторые типы клетки более чувствительны чем другие к механически усилию, чрезмерно методы разобщенности могут смещения ваше населенность.
Общая диссоциация имеет решающее значение для достижения высоких урожаев клеток, и точное представление состава тканей. После этого используйте 40-метровый фильтр поверх конической трубки 50 миллилитров, чтобы дважды отфильтровать каждый образец ткани. Промыть фильтр одним процентом BSA/HBSS.
После центрифугирования образцов, описанных в рукописи, повторно приостанавливайте гранулы клеток в HBSS, содержащие один процент BSA, используя широко скважинный наконечник, и поместите на лед. Добавление красителя жизнеспособности поможет вам оптимизировать ваш препарат. Вы должны стремиться, по крайней мере 80 процентов жизнеспособных клеток.
После оптимизации, этот и другие шаги контроля качества могут быть опущены для того, чтобы ускорить процесс диссоциации, что позволит лучше сохранить качество РНК и уменьшить потерю клеток. Чтобы изолировать жизнеспособные и здоровые клетки с помощью FACS, сначала подготовьте 15 миллилитров узкодонных трубок с восемью миллилитров ледяного 1 процента BSA/HBSS для сбора образцов. Для обеспечения того, чтобы интерфейс между поверхностью жидкости и внутренней частью трубки был влажным, а также для предотвращения статического и поверхностного натяжения, инвертировать трубки перед коллекциями.
Сразу же после сортировки клеток FACS, как только клетки собираются в 15 миллилитровую трубку, используйте один миллилитр одного процента BSA/HBSS, чтобы мыть и толкать все клетки вниз от боковой поверхности трубки. Затем центрифуга каждого образца на 260 г в течение восьми минут. После отказа от супернатанта, повторно приостановить ячейки гранулы в один процент BSA / HBSS, и добавить 33,8 микролитров в трубку, и держать трубку на льду.
Этот шаг предназначен для использования реагентов, полученных из стандартизированного комплекта. Все продемонстрированые шаги должны выполняться в соответствии с инструкциями производителя. Чтобы подготовиться к генерации GEM, поместите чип в держатель чипа, подготовьте смесь мастера ячейки на льду, согласно протоколу производителя.
Добавьте 56,2 микролитров мастер-микса в трубку, содержащую 33,8 микролитров самооправляемой. Чтобы подготовить чип, сначала на 50 процентов глицерол для скважин, которые не будут использоваться. Затем добавьте 90 микролитров смеси мастера клеток к хорошо одному, 40 микролитров гелеобразных бусин хорошо два, и 270 микролитров перегородки масла к хорошо три.
Обложка чип с прокладкой. Чтобы загрузить чип, и запустить в одноклеточный контроллер, сначала извлечь лоток. Поместите чип в лоток.
Увяйте лоток и нажмите игру. После полного запуска соберите 100 микролитров образца и поместите в трубку ПЦР. Поместите ПЦР трубки в предустановленную машину PCR и запустите в соответствии с комплектом.
После запуска, GEMs будет включать в себя полнометражный, штрих-код cDNA, от полиаденилатной мРНК. Поместите трубки при температуре минус 20 градусов по Цельсию на ночь. Продолжить строительство библиотеки, секвенирование, выравнивание и анализ.
После того, как образцы секвенированы и выровнены, как описано в рукописи, депонировать данные в общедоступный репозиторий, таких как GEO NCBI. Для этого зарегистрируйтесь на учетную запись отправителя. Во-первых, заполните представление GEO, загрузив лист метаданных.
Убедитесь в том, чтобы включить только один лист метаданных на представление проекта. Поместите электронную таблицу в каталог. Во-вторых, добавьте в каталог необработанный файл данных, генерируемый из сценария подсчета ячеек для всех библиотек.
Третья папка обрабатывается файлами данных. Поместите обработанные файлы данных, полученные из сценария подсчета ячеек для всех библиотек, в каталог. Используйте учетные данные сервера FTP отправителя GEO для передачи каталога, содержащего все три компонента.
После запуска Cell Ranger, готовые к анализу матрицы генного штрих-кода могут быть дополнительно обработаны с помощью передовой биоинформатики. Во-первых, предварительная обработка количества проверок была проведена с использованием пакета Seurat R, который генерируется скрипки и рассеяния участков для визуализации количества генов, количество уникальных молекулярных идентификаторов, и процент митохондриальных генов для выявления клеток дублетов и выбросов. Для выбора основных компонентов, или ПК, использовались локтевые участки, в которых были исключены ПК за пределами плато стандартного отклонения оси ПК.
Было также манипулировать разрешением кластеризации. Низкое разрешение привело к уменьшению кластеров ячееок, при этом каждый кластер, вероятно, представляет определенный тип ячейки. Высокое разрешение привело к более высокой вероятности клеток, представляющих подтипы, или переходные состояния, популяции клеток.
Настройки кластера низкого разрешения использовались для дальнейшего анализа карт экспрессии тепла для определения наиболее высоко выраженных генов в данном кластере. Отдельные гены-кандидаты визуализировались на участках tSNE, используя функцию сюжета Seurat, что позволяло расшифровывать, были ли кластеры, которые представляли, например, макрофаги. Оба кластера два и четыре выраженных CD68, пан-макрофаг маркер.
Другие пакеты также предоставляют инструменты для контроля качества, например, Monocle, пакет R, используемый для построения траекторий ячейки, удаляет некачественные ячейки и гарантирует, что распределение мРНК по всем ячейкам является нормальным журналом и упало между верхними и нижними границами. Одиночные клетки после этого были классифицированы и подсчитаны, используя известные гены маркера линии, и клетки выражая маркеры интереса были заданы к типу клетки одно. Было установлено, что тип клетки номер один были фибробласты.
Эта популяция была оценена для построения траектории развития фибробластов. После этой процедуры, другие методы, такие как количественный ПЦР, на месте гибридизации, иммунологической химии должны быть выполнены для проверки точности результатов экспрессии генов. Одноклеточное секвенирование мРНК в настоящее время проложило путь для исследователей во многих различных областях, чтобы исследовать неоднородность клетки к клетке, и определить функциональную динамику в различных тканях во время гомеостаза, и как они могут измениться после травмы или в развитии болезни.
