Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области фармакологии сердечной безопасности. Например, несет ли новая человеческая медицина риск изменения нормального сердечного ритма? Основным преимуществом этого метода является то, что он может оценить большое количество соединений быстро и при умеренных затратах.
Демонстрацией процедуры будет Камилла Forny, научный сотрудник в моей лаборатории. Чтобы подготовиться к измерению сокращений синцитии человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов, или HIPSCCMs, начните с размещения CryoTubes содержащие замороженные клетки в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение двух минут. Перенесите всю талую сотовую суспензию с каждой трубки на одну, свежую 50 миллилитровую коническую трубку.
Чтобы получить оставшиеся клетки, мыть каждую трубку с одним миллилитр 37 градусов по Цельсию довоенной среды покрытия и добавить эту среду в 50 миллилитров конической трубки, содержащей талые клетки. Добавьте восемь миллилитров теплой пластины среды в трубку и тщательно перемешайте подвеску. Используйте метод trypan голубого исключения и гемоцитометр для подсчета живых клеток.
Добавляя теплую среду покрытия, отрегулируйте концентрацию до 50 000 клеток на миллилитр. Чтобы распределить клетки на две новые пластины культуры клеток на 384 колодец, добавьте по 25 микролитров к каждой колодец, что даст около 12 500 клеток на колодец. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в 384-хорошо пластин во влажной атмосфере с 5%углекислого газа в общей сложности от трех до четырех недель.
На следующий день замените покрытие среды на 50 микролитров теплой среды обслуживания. После этого заменяем половину среды обслуживания каждые два-три дня. В дни семь, 14 и 21, заменить средний полностью.
После того, как клетки были сохранены в культуре в течение трех-четырех недель, они сформировались спонтанно контракт синцитии, и влияние соединений на эти сокращения могут быть измерены. В день анализа, по крайней мере за два часа до того, как первая пластина ячейки должна быть помещена внутри считывателя пластины для измерения, включите считыватель и установите систему отопления на 37 градусов по Цельсию. Для приготовления составных пластин, теплой до комнатной температуры 40 миллилитров среднего обслуживания дополняется 1%объем за объем пенициллина стрептомицин.
В то время как среда разогревается, распределить тестовые соединения и элементы управления на две 384-хорошо соединения пластин, добавив 1,5 микролитров запасного раствора на колодец. Центрифуга соединения пластин при 100 G в течение одной минуты. Добавьте 37 микролитров среднего обслуживания к каждой хорошо и центрифуга пластин снова на 100 G в течение одной минуты.
Для приготовления флуоресцентного красителя, теплые 100 миллилитров среднего обслуживания дополняется 1% объема за объемом пенициллина стрептомицин в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Затем добавьте 10 миллилитров разогретой среды в смесь чувствительного к кальцию флуоресцентного красителя и утолите их в качестве среды флуоресценции запасов. Запустите программное обеспечение для чтения пластин.
Подготовь программное обеспечение для записи двухминутного сегмента кальциевых волн с частотой приобретения не менее 10 герц. Чтобы сделать флуоресценцию средней для каждой клеточной пластины, разбавить три миллилитров стока флуоресценции среды с 12 миллилитров теплой среды обслуживания с антибиотиками. Замените 20 микролитров среднего в каждом колодеце клеточной пластины 30 микролитров флуоресцентной среды и смешайте с помощью трубок вверх и вниз один раз.
Сразу после этого поместите пластину в считыватель пластин, чтобы HIPSCCMs приспособиться к температуре читателя в течение 60 минут. Затем запустите программное обеспечение для чтения пластин. Запись двухминутный сегмент кальциевых волн с частотой приобретения не менее 10 герц, чтобы определить базовую скорость избиения для каждой хорошо.
Важно убедиться, что пластина ячейки не передается из устройства после получения данных. С некоторыми версиями программного обеспечения, вы должны остановить запись, прежде чем она заканчивается полностью. Используйте робота-считыватель пластин для пипетки пять микролитров теста и ссылки соединений хорошо от соединения пластины в клеточной пластине.
После этого начните сбор данных в программном обеспечении для считыватель пластин для записи двухминутных сегментов волны кальция, начиная с 5, 15, 30, 45 и 60 минут после добавления соединения. Для начала анализа данных экспорт необработанных данных за каждый период записи из программного обеспечения для чтения пластин в текстовых файлах ASCII. А затем импортировать их в программное обеспечение для анализа данных.
Из программного обеспечения для анализа данных экспорт основных частот избиения для каждого периода записи в качестве копий буфера обмена. Извлекайте первичную частоту избиения для каждого хорошо и каждый раз точки. Наконец, импортируют частоты избиения в программное обеспечение электронной таблицы путем буфера обмена и продолжают анализ данных, описанный в текстовом протоколе.
Запись волны кальция на базовом уровне через один 384-хорошо пластины показывает, что в большинстве случаев все скважины показывают регулярную скорость избиения с небольшой изменчивостью по всей пластине. При добавлении блокаторов сердечных ионных каналов они влияют на ритм кардиомиоцитов. Амлодипин, блокатор медленных кальциевых каналов, ускоряет ритм более чем на 100% в зависимости от концентрации до одного микромолара.
И выше этого, амлодипин арестовывает избиение. E-4031, блокатор быстрого задержки выпрямителя калийных каналов замедляет ритм около 65 до 70% в зависимости от концентрации образом до 10 микромолей. Тетродотоксин, блокатор быстрых каналов натрия замедляет ритм около 15% в концентрации зависимой образом до одного до 30 микромолей, в то время как выше 30 микромолейных, тетродотоксин арестовывает избиение в течение первых пяти минут.
Bepridil, смешанный блокатор сердечного натрия, кальция и калия каналов также производит все или ничего эффект, предполагая, что блок канала натрия является основным действием bepridil. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы быть чрезвычайно мягким, когда трубопроводов в пластине культуры клеток. Эти ткани очень хрупкие и легко повреждаются при прикосновении пипеток.
Не забывайте, что работа с клетками человека и активными препаратами может быть опасной, и такие меры предосторожности, как ношение защитных перчаток и очков, всегда должны приниматься при выполнении этой процедуры.
