Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области терапии рака, такие как определение ключевых генов, участвующих в онкогенной зависимости. Основным преимуществом этого метода является то, что он использует онкогенной зависимости, которая является общей для многих киназы приводом рака поэтому это применимо к нескольким типам опухолей. Хотя этот метод может обеспечить понимание лейкемии, он также может быть применен к другим системам, как твердые опухоли, такие как рак легких, опухоли головного мозга, и опухоли поджелудочной железы.
Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться из-за отсутствия опыта в молекулярной биологии и клеточной физиологии. Для начала со собрала кости ног из усыпанной мыши. Очистите ткани от костей скальпелем.
Затем поместите кости в холодный PBS на льду и раздавить кости с пестиком. После этого, фильтровать подвеску клетки через 70 микрометровый ситечко клеток в 50 миллилитров винт крышка трубки с 10 миллилитров пипетки. Вымойте раствор и пестик несколько раз с холодной PBS и добавить клеточной подвески на 50 миллилитров трубки.
Далее центрифуга костного мозга и удалить супернатант с вакуумом и стеклянной пипеткой. Повторное распределение клеточных гранул в 5 миллилитров PBS. Используя пипетку, медленно добавляйте подвесной костный мозг к верхней части комнатной температуры поли-сахарозы.
После этого, спина поли-сахарозы на 400 Gs в течение 20 минут с тормозом выключен. После центрифугации соберите облачное полное моноядерное интерфейс ячейки с помощью пипетки и перенесите его в новую 15-миллилитровую трубку. Довнесите громкость до 10 миллилитров с помощью PBS и удалите 20 микролитров для подсчета.
После центрифугации отбросьте супернатант и поместите гранулы на лед. Далее, повторное распределение клеточных гранул в PBS с EDTA и BSA. Добавить CD117 микробусы к подвеске клетки, и вихрь, чтобы смешать.
После этого инкубировать подвеску в течение 10 минут при 4 градусах по Цельсию. Затем довести громкость до 10 миллилитров с большим PBS с EDTA и BSA и центрифуги на 1200 G при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут. Используйте вакуум, чтобы удалить супернатант и приостановить ячейки гранулы в PBS с EDTA и BSA.
Затем добавьте 3 миллилитров PBS с EDTA и BSA к магнитному стенду с магнитной колонкой и дайте ему потечь в трубку сбора. После завершения работы буфера, протекающего через столбец, добавьте подвеску ячейки и дайте ей протекать через столбец в трубку сбора. Затем добавьте еще 5 миллилитров PBS с EDTA и BSA в колонку и смойте его немедленно с поршенем.
Удалите поршень и повторите флеш перед подсчетом ячеек. После центрифугирования клеток, удалить супернатант и приостановить ячейки гранулы в полном IMDM для культуры. Культура клетки ночь на 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа.
Во-первых, объединить ретровирусную плазминовую ДНК с упаковочной плазмидой, хлоридом кальция и водой в 1,5 миллилитровой трубке. Затем добавьте 500 микролитров HBS в другую 1,5 миллилитровую трубку. Добавьте трансфектную смесь, содержащую HBS, в трубку, содержащую HBS, одновременно смешивая с набором вихрей до самой низкой настройки.
Инкубировать трансфекцию смесь при комнатной температуре в течение 20-30 минут. В инкубационный период добавьте хлорохин в клетки HEK и держите их в инкубаторе. После добавления трансфекции смесь, инкубировать клетки в течение 8 часов в 37 градусов по Цельсию 5%CO2 инкубатор изменения клеточных средств массовой информации, добавив 14 миллилитров свежих DMEM10 средств массовой информации очень медленно.
Трубопровод медленно к стене тарелки помогает предотвратить любое зачистку клеток HEK. Затем инкубировать клетки на ночь в 37 градусов по Цельсию 5%CO2 инкубатор. Используйте 10 миллилитров шприц для сбора вирусного супернатанта.
Затем прикрепите к шприцу фильтр шприца 0,45 микрометра. Окунитесь вирусный супернатант в новую трубку коллекции. Соберите вирусный супернатант примерно через 16 часов.
После этого добавьте два миллилитров рекомбинантного фрагмента фибронектина человека в PBS к необработанным 6 хорошо культурным пластинам. На следующий день используйте пипетки, чтобы удалить фибронектин из пластин. Заблокировать пластины с 2%BSA в PBS и инкубировать пластины при комнатной температуре в течение 30 минут.
Используйте вакуум, чтобы удалить BSA и мыть пластины с PBS, прежде чем удалить его с вакуумом. После этого немедленно добавьте отфильтрованный вирусный супернатант и центрифугайте пластину в течение двух часов. Используйте вакуум, чтобы удалить супернатант и спина пластины снова.
Затем удалите супернатант с вакуумом и мыть вирусные покрытые колодцы с PBS. Удалить PBS с вакуумом, добавить ранее культурных c-Kip плюс мышиные клетки для вирусного покрытием скважин. После центрифугации инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе.
Через 48 часов после трансдукции гранулы клеток через центрифугирование и повторно их в буфере FACS 1. Первая оттепель метилцеллозы с цитокинами для мышей при комнатной температуре. Затем aliquot 3 миллилитров метил-целлюлозы в трубке FACS.
Добавьте 100 микролитров клеточной суспензии с соответствующими ингибиторами в 3 миллилитров метил-целлюлозы. Затем вихрь подвески на высоком в течение 10 до 30 секунд. После того, как большинство пузырьков воздуха бежать, использовать 1 миллилитров шприц пластины 1 миллилитр средств массовой информации в трех пластин репликации.
Поместите тарелки в большую чашку Петри вместе с одной открытой тарелкой, содержащей стерильную воду. Затем накройте большую чашку Петри и инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию. Подготовка iodonitrotetrazolium хлорид пятно путем растворения 10 миллиграммов хлорида иодонитротетразола в 10 миллилитров воды.
Фильтр стерилизовать окрашивание раствор с Luer замок шприц оснащен 0,2 микрометрового фильтра. В ткани культуры капот, добавить 100 микролитров окрашивания раствора капли мудрый вокруг пластины CFU. Затем инкубировать пластины на ночь при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе клеточной культуры.
Наконец, после того, как колонии стали темно-красного коричневого цвета, использовать белый фон в стерильной ткани культуры капюшон, чтобы сфотографировать окрашенные пластины CFU. В этом протоколе, несколько объективных анализов экспрессии генов были использованы для выявления генетического компонента, который организует онкогенной зависимости. Для подтверждения роли c-Fos и Dusp1 в качестве терапевтической мишени при лейкемии, их переэкспрессия была подтверждена клетками, выражают онкоген BCR-ABL1.
Анализ с помощью RT-qPCR и западной blotting подтвердил, что оба были вызваны BCR-ABL1 и что их выражение увеличивается фактором роста Ил-3. YFP плюс экспресс-клетки были отсортированы через FACS для дальнейших анализов in vitro и in vivo. Результаты показали, что удаление c-Fos и Dusp1 только препятствует CFU номера.
Клетки, не имеющие как c-Fos, так и Dusp1, были значительно скомпрометированы в своей способности образовывать колонии, а лечение Иматиниба уничтожило все CFUs, что указывает на то, что потеря c-Fos и Dusp1 является синтетически смертельной для выражения BCR-ABL1. После этого развития, этот метод проложил путь для исследователей в области рака, чтобы исследовать генетические сети и гены вождения онкогенной зависимости и как эти гены влияют на их конкретную реакцию в мышиных моделях и человеческих пациентов. Не забывайте, что работа с ретровирусами и образцами пациентов может быть чрезвычайно опасной и безопасной лабораторной практики должны наблюдаться при выполнении этой процедуры.
