Эхокардиография плода и импульсной волны ультразвуковая допплерография в модели кролика внутриутробной задержки роста

Мы описываем обследование плода сердечной функции с современными функциональными эхокардиографии плода и фетоплацентарного ультразвуковая допплерография использованием VisualSonics VEVO 2100 microultrasound в хирургически индуцированной модели внутриутробной задержки роста плода у кролика.

Плода внутриутробное ограничение роста (ЗВУР) приводит к ненормальной сердечной функции, что очевидно антенатально из-за достижения в фетоплацентарной ультразвуковая допплерография и эхокардиография плода. Все чаще эти методы визуализации принимаются на работу в клинике для изучения сердечной функции и оценки благополучия в матке, тем самым руководящие времени рождения решений. Здесь мы с помощью модели кролика ЗВУР, что позволяет провести анализ сердечной функции у клинически значимые пути. Изофлураном индуцированной анестезией, IUGR хирургическим создан на сроке 25 дневного возраста, выполняя лапаротомию, обнажая двурогая матка, а затем лигирование 40-50% маточно-плацентарного сосуды, снабжающие каждый плодного яйца в одном роге матки. Другой рог матки двурогая кролика служит внутренний контроль плодов. Затем, после восстановления на сроке 30 дневного возраста (полный срок), того же кролика проходит обследование плода сердечной функции. Анестезия индуцируют ketamнеравенство и ксилазина внутримышечно, затем поддержаны непрерывным внутривенным введением кетамина и ксилазина, чтобы минимизировать ятрогенные воздействия на функцию сердца плода. Повторите лапаротомии выполняется подвергать каждое плодное яйцо и microultrasound обследование (VisualSonics VEVO 2100) плода сердечная функция выполняется. Плацентарная недостаточность видно по Повышенный индекс пульсации или отсутствует или обратной конечного диастолического потока пупочной артерии доплеровского сигнала. Венозном протоке и средней мозговой артерии доплеровского тогда исследована. Эхокардиография плода осуществляется записи B режиме M режим и скорость потока сигналов в боковых и апикальных взглядов. Offline расчетов определить стандартные M-режиме сердечной переменных, трехстворчатого и митрального кольца экскурсию систолического плоскости, спекл отслеживания и анализа деформаций, изменение индекса производительности миокарда и сосудистых скорость потока сигналов, представляющих интерес. Этот небольшой животной модели IUGR поэтому дает рассмотрение в Uterо сердечной функции, которая согласуется с современной клинической практике и, следовательно, полезны в поступательное установку исследований.

Бремени сердечно-сосудистых заболеваний, что результаты от плода внутриутробная задержка развития (ЗВУР), не может быть переоценена. Это является основной причиной мертворождений после врожденных аномалий. ¹ IUGR относится к плоду, что не в состоянии достигнуть потенциал его роста и обычно в результате плацентарной недостаточности. ² У выживших, сердечно-сосудистые болезни очевидна на протяжении всей жизни с очевидной дисфункции миокарда в младенчестве и детстве ^3,4 и последующих ⁵ гипертонии, диабета ⁶ и ожирение развивается во взрослой жизни - все накопленные сердечные факторы риска от рождения к преждевременной смерти от ишемической болезни сердца ^7.

Разработка животных моделей для характеристики матери и плода, который устанавливает связь IUGR и последующего плода ответ на снижение доступности субстрате необходима, если мы хотим как лучше понять патофизиологию IUGR связанных автомобилянарушения сердечной и развивать сердечно-защитных стратегий по улучшению плода и послеродового здоровья. В этом отношении множество различных моделей у разных видов были описаны. ⁸ IUGR обычно индуцированного материнского при питании с низким содержанием белка у грызунов, ⁹ хирургической абляцией или лигирование маточного кровотока у грызунов и морских свинок ¹⁰ или окклюзии пупочной артерии у овец. ¹¹ Тем не менее, очевидно, что ни одна модель полностью повторяет человека IUGR ^12.

В нынешней методологические исследовании мы использовали хорошо проверенных подхода селективного маточно-плацентарного сосудистого перерывом в ^13-16 кролика, который не только производит плода сердечно-сосудистой реакциях, наблюдаемых с помощью ультразвука ¹⁴ клинически, но и позволяет допроса плода сердечной функции с использованием эхокардиографии романа microultrasound технологии из VisualSonics VEVO 2100. В то время как доплеровский УЗИ fetoplacental суда остается краеугольным камнем текущей дородовых плодов IUGR ^17, функциональные эхокардиографии все чаще используются для обеспечения новому взглянуть на болезнь патофизиологии и для оценки благополучия плода. ¹⁸ Соответственно, здесь мы принимаем эти авансы от клинических исследований и описать, что животная модель гаваней не только изысканность этого изображения, но и обеспечивает экспериментальную площадку для расследования механистической путей и новых терапевтических средств.

Соответствующий протокол экспериментального утверждается животных Комитета по этике, Католический университет Левена, Левен, Бельгия. Мы следовали ранее описанной хирургической процедуры ¹³ в том числе некоторые методологические изменения, особенно в анестезии процедуры.

1. Склонение задержка внутриутробного развития (ЗВУР)

1. Время от беременных кроликов (гибридные Дендермонде и Новой Зеландии белый) размещены в индивидуальных клетках на 12/12 ч света график с доступом к воде и стандартной кролика чау вволю от гестационного возраста (GA) 18 дней. На GA 25 дней (полный срок составляет 31 дней приблизительно), кроликов передаются в операционную для хирургического создание IUGR. До операции случайно выделить "дело" (ЗВУР) и "контроль" в рог матки двурогая матки кролика с помощью рандомизации программное обеспечение (GraphPad Software, США) ^19. Размер выборки должен быть определен расчета мощности отдельных Researchers для их вопрос, представляющий интерес.
2. Анестезия процедуры.
   Вводного наркоза достигается путем введения кетамина 35 мг / кг (Сева Санте Animale, Брюссель, Бельгия) и ксилазина 5 мг / кг (Сева Санте Animale, Брюссель, Бельгия) внутримышечно в заднюю ногу. Анестезия затем поддерживается с ингаляционной смеси 1-4% изофлурана (Isoba Vet; Abbott Laboratories ООО, Queenborough, графство Кент, Великобритания) в O ₂ на 2 л / мин. Наведите пульсоксиметр (Nellcor N-20, Covidien, Ирландия) по материнской второй и третий палец постоянно контролировать частоту сердечных сокращений и артериальное O ₂ насыщения.
3. Хирургической процедуры.
   1. Премедикация. Перед началом операции, управлять антибиотикопрофилактикой пенициллин G, 300 000 МЕ (Kela Pharma, Hoogstraten, Бельгия), маточные токолитическую медроксипрогестерона ацетат 0,9 мг / кг (Депо-Провера, Pharmacia Upjohn, Puurs, Бельгия) и обезболивающее бупренорфин 0,03 мг / кг (Temgesic; Schering-Plough) Подкожно в одном 2,5 мл шприца.
   2. Кролик подготовки. Поместите кролика на потепление площадку на время операции. Удалить волосы из брюшной операционного поля и применять антисептические повидон-йод 7,5% (Бетадин, Пердью, штат Коннектикут, США). Полный асептических протокол затем используют.
   3. Брюшной лапаротомии. Проникнуть месте разреза с местным анестетиком (2 мл 1% раствора лидокаина, B Braun Medical, Бельгия) подкожно. Разреза должна быть примерно 5 см в длину по средней линии, в нижней 2/3 брюшной полости. После того как кожа открыта, использовать смесь острым и тупым, чтобы разоблачить влагалище прямой мышцы живота. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать сосудистых материнской молочной железы, расположенные обе стороны от средней линии на входе (рис. 1А). Возьмитесь влагалища прямой мышцы живота и брюшины, палатка для предотвращения случайного включения содержимого брюшной полости, и осторожно войти, используя резкой расчлененности (рис. 1В).
   4. Миома экстериоризации. Объемный операционное поле марлей шторы пропитанной солевым нагревается. Осторожно возьмитесь и экстериоризироваться обеих сторон двурогая матка. Необходимо соблюдать осторожность, не размещать либо вагинальный или яичников конце каждого рога матки под напряжением, так как это может привести к нежелательным кровотечение, боль и сократимость матки. Помощник непрерывно орошает подвергается матки с подогреваемой физиологического раствора, чтобы предотвратить сокращение матки. Пропальпируйте и записывать количество плодов в каждой рога. В соответствии с соглашением, плод в конце яичников обозначен первый плод. Один рог матки в случае рога и других является контроль рога. Определить ранее рандомизированы случае рога для IUGR индукции, а затем заменить контроль рог обратно в брюшную полость (внутренние плодов управления).
   5. Хирургически индуцированной IUGR. Определить сосудов маточно-плацентарного друг плодного яйца в указанном случае рог (рис. 1в).Хирургически перевязывать 40-50% этих судов, использующих 5-0 полиглактин шва (Ethicon Vicryl, Джонсон и Джонсон Медицинские, США) (рис. 1D-1E). На практике часто возникают три сосудистых пучков подачи каждого плодного яйца. В этом случае, крупнейший сосудистого пучка лигируется. После завершения, матка снова орошаемых подогретым раствором и тщательно вернулся в животе.
   6. Брюшной закрытия. Закройте живота в двух слоев с помощью непрерывной работы 2-0 полиглактин шва (Ethicon Vicryl, Джонсон и Джонсон Медицинские, США). Закройте кожи подкожные 3-0 полиглактин шва (Ethicon Vicryl, Джонсон и Джонсон Медицинские, США). Спрей алюминиевый аэрозоль на рану, чтобы предотвратить кролик из более поздних вмешательства в швами.
   7. Восстановление. Прекратить анестезии и внимательно наблюдать восстановление дыхания. Кролика, затем размещены как описано выше, с доступом к пище и воде и наблюдали ежедневно.

2. Выполнение эхокардиографии плода и импульсной волны ультразвуковая допплерография

1. Того же кролика затем переносится на GA 30 дней для эхокардиографии и ультразвуковой оценки. Кролика помещают на потепление площадку в течение всего срока проведения экспертизы.
2. Анестезия процедуры.
   1. Вводного наркоза достигается путем введения кетамина 35 мг / кг (Сева Санте Animale, Брюссель, Бельгия) и ксилазина 5 мг / кг (Сева Санте Animale, Брюссель, Бельгия) внутримышечно. Как только степенный, получить доступ с использованием внутривенного канюли 24 калибра (BD Insyte-З, Becton Dickinson инфузионной терапии Systems, штат Юта, США), вставленный в периферическую вену ушной.
   2. Поддержание анестезии непрерывной инфузии кетамина и ксилазина: 2 мл кетамина (100 мг / мл) и 1,5 мл ксилазина (20 мг / мл) в 46,5 мл физиологического раствора, а затем придают с помощью шприца со скоростью 40 мл / час. Закрепите трехсторонней кран и приложите 5 мл шприц спасательных анестезии: 2 млкетамина (100 мг / мл) и 1,5 мл ксилазина (20 мг / мл). Болюсы анестезией 0,5 мл спасательных требуются редко. Администрирование анальгетик бупренорфин 0,03 мг / кг (Temgesic; Schering-Plough) subcutaneouslyprior к операции. Кислород 2 л / мин наносят маску. Наведите пульсоксиметр (Nellcor N-20, Covidien, Ирландия) по материнской второй и третий палец постоянно контролировать частоту сердечных сокращений и артериальное O ₂ насыщения.
3. Брюшной лапаротомии и маточных экстериоризации. См. 1.3.3 и 1.3.4.
4. Плод позиционирования для эхокардиографии и ультразвукового исследования.
   1. Поместите кролика в боковом положении, обращенной к исследователю. Это облегчает проще извлечения одного плодного яйца на рассмотрение и предотвращает чрезмерную тягу на маточно-плацентарного сосудов. Насколько это возможно, постарайтесь экстериоризироваться только одно плодное яйцо в то время, чтобы свести к минимуму воздействие. Убедитесь, что подвергается плодного яйца помещают на марлю орошаетсянагревается физиологического раствора. Для обеспечения стандартизированных результатов между различными исследовательскими группами, как правило, только плода на яичников и вагинальный концах каждого рога матки используются в ультразвуковом исследовании.
   2. Плод сердечной функции очень восприимчивы к эффекту матки экстериоризацию, изменение температуры и давления от ультразвукового преобразователя на плацентарный сосудов. Для минимизации этих экологических и ятрогенные смешанное воздействие на функцию сердца, ультразвуковое исследование должно начинаться сразу после экстериоризации плодного яйца и должно быть систематическим и эффективным. По нашему опыту, изменения в функции сердца плода редко происходит в первые 5 мин воздействия. Если брадикардия плода встречается, удалите ультразвукового зонда, измените положение плода, чтобы предотвратить перегибы фетоплацентарной сосудов, орошают с подогреваемой физиологический раствор или кратко вернуться плодное яйцо обратно в материнский живот. Если брадикардия плода является постоянной, это экзамен для FeЕП следует отказаться в пользу изучения следующего плода.
5. Эхокардиография плода.
   1. Visualsonics VEVO 2100 (Торонто, Канада) с высоким разрешением microultrasound платформы с сердечными-деформированного состояния программного обеспечения, установленного требуется. VisualSonics MS-250 преобразователь (VisualSonics, Торонто, Канада) используется для сбора данных. Это имеет центральную частоту 21 МГц с шириной полосы частот 13-24 МГц. Геометрический фокус 15 мм, максимальная ширина изображения составляет 23 мм и максимальную глубину изображения 30 мм. След 28 х 5,75 мм. Данные получают в соответствии с Американского общества эхокардиографии руководящих принципов и стандартов для выполнения эхокардиографии плода. ⁺²⁰
   2. Сбор данных 1: вид сбоку на уровне боковой четыре камеры зрения, записи в В-режиме кинопетли по меньшей мере пяти сердечных циклов для определения напряжения, скорости деформации, скорость и смещение.. Это проанализированы оффлайн, используя VevoStrain(Visualsonics, Торонто, Канада) алгоритм, как описано ранее в журнале подробно. ²¹ М-режиме эхокардиографии индексы могут быть получены в этом стандартном виде. Offline измерений как структуры и функции сердца могут быть проанализированы: внутренние перегородки желудочка и диаметра в систолу и диастолу, объемы, ударный объем, фракция укорочения, фракция выброса и сердечный выброс ^21.
   3. Сбор данных 2. Апикально На уровне апикальной четыре камеры зрения, в В-режиме кинопетли может быть повторен для VevoStrain анализов, как описано выше. М-режиме эхокардиографии используется для оценки трехстворчатого (TAPSE) и митрального кольца экскурсию систолического плоскости (МАП) и продольные деформации и скорости деформации. ^22,23 Это апикально также позволяет оценить клапанной скорость потока сигналов и модифицированный инфаркт индекса производительности, как ранее описано. ⁺²⁴
6. Фетоплацентарная импульсно-доплеровской махнул ииrasound.

Скорость потока сигналов (FVW) из пупочной артерии получены за счет размещения сосудов пуповины использованием цветного допплеровского, а затем размещения импульсный доплеровский образца ворот над пупочной артерии на свободную петлю пуповины. ⁺²⁵ Средней мозговой артерии (СМА) является FVW расположенных путем размещения импульсного образец доплеровского ворот только за начало MCA раз Круг Уиллис находится по цвету Доплера. ²⁶ венозного протока (DV) FVW получают, помещая образец импульсного доплеровского ворота в проксимальной части DV видно с цветного допплеровского где это происходит из пупочной вены внутрипеченочными либо в сагиттальной или поперечный вид плода. ⁺²⁶ индекса пульсации (PI) рассчитывается форума VisualSonics использованием программного обеспечения для анализа сердечно-сосудистых.

Асимметричный рост ограничен плода и плаценты из маточно-плацентарного сосудистого лигирование по сравнению с нормальным плода управления и плаценты на фиг.1F. Асимметричный роста подтверждается пониженной массой тела при рождении новорожденных и увеличение окружности головы: брюшной соотношения окружности с контрольной группой. Представитель результаты исследования фетоплацентарного доплеровского показаны на рисунке 2. Нормальный низкий резистентности положительного конечного диастолического потока в контрольной плода показан. При прогрессирующем увеличении сопротивления плацентарного видели в ЗВУР плода, а затем отсутствие обратной конечного диастолического потока очевидна. 3 демонстрирует высокую устойчивость нормальных средней мозговой артерии доплеровского сигнала в здоровом плода и положительной волной венозном протоке в том же плода. В ЗВУР плода, повышенная пульсация индекса венозного протока и уменьшение волны можно увидеть. ¹⁴ Результаты представитель от М-режиме эхокардиографии плода затем показано на рисунке 4. Этот вид сбоку позволяет рассчитать внутренние диаметры и объемы желудочка. Апикально позволяет рассчитать TAPSE и МАП. 5 показаны спекл отслеживания векторов скорости и полученные кривые региональных штамм для расчета напряжения, скорости деформации, смещения и скорости.

Рисунок 1. Хирургическая техника создания IUGR в модели кролика: Средняя линия лапаротомии подвергая влагалище прямой мышцы живота, стрелка = mammory желез; B:. Безопасного входа в брюшную полость; C: стрелка = маточно-плацентарного сосудов, снабжающих плодного яйца; D: шов методом; E: стрелки = завершено перевязки маточно-плацентарного судна; F: представитель управления и плода и плаценты IUGR.

Re 2 "SRC =" / files/ftp_upload/50392/50392fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Ультразвуковая допплерография из пупочной артерии: положительные конечного диастолического потока (EDF), B:. Отсутствует конечного диастолического потока (AEDF); C: Обратный конечного диастолического потока (REDF).

Рисунок 3: ультразвуковая допплерография венозного протока, S = S волны (сокращения желудочков систолического), D = D волны (в начале диастолы желудочков), а = волны (сокращения предсердий); B:. Допплерографии средней мозговой артерии .

Рисунок 4. M режиме эхокардиографии:. Боковых четырех камер, LVID левого желудочка = внутренний диаметр, ДМЖП = внутрижелудочковой перегородки диаметре, RVID = правый веntricular перегородки диаметре, ОУР = конечного систолического диаметра, ЭДД = конечного диастолического диаметра; B: апикальные видом демонстрируя трикуспидального кольца экскурсию систолического плоскости (TAPSE); C: апикальные видом демонстрируя митрального кольца экскурсию систолического плоскости (МАП).

Рисунок 5. Плод анализа сердечного деформации: Регион интерес определяется эндо-и эпи-кардий левого желудочка; B:. Скорость деформации кривые шести сегментов миокарда, SR = систолического пика скорости деформации; C: Штамм кривые шести сегментов миокарда, кв = систолического пика напряжения. Сердечная движения изображены M режиме демонстрации концу диастолы (ED) и конечным систолы (ES). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Мы использовали ранее подтверждены подход хирургическим снижение маточно-плацентарного кровотока у кролика для производства IUGR ^13-16, а затем изучения сердца плода функцию ¹⁴ для описания технологии microultrasound и сердечной функции анализа доступны на VisualSonics VEVO 2100. Способность к воспроизводству фетоплацентарном доплеровского изменения человеческих плодов IUGR в небольшой модели животных и затем позволить обследование сердечной функции с недавно описал эхокардиографии, скорее всего, прогресс исследования сердца плода в клинически значимые пути.

Малый животных моделях обычно полагаются на материнской ограничение калорий или низкое потребление белка ^9, однако они ограничены неспособностью продемонстрировать уменьшена плацентарный кровоток, основной механизм IUGR в развитых странах. ²⁷ Кроме того, хирургические перевязки маточных двусторонних артерий у крыс, в то время обычно сообщают, не воспроизводимо результате яN ограничения роста. ⁺²⁸ В нынешней методологии в кролика плодов, мы показываем плацентарной недостаточности быть очевидным отсутствие или обратной конечного диастолического потока пупочной артерии доплеровского (UA AREDF), в соответствии с выводами в ультразвуковом IUGR человека. Было экспериментально показано, что повышенная устойчивость в этом доплеровский сигнал отражается вниз по течению сопротивление току крови в сосудистом русле плацентарных и свидетельствует о плацентарной недостаточности ²⁹ Наличие UA AREDF становится очевидным, когда 50 -. 70% от ворсинок сосудистой дисфункциональных . ^30,31 Клинически UA AREDF является мощным предиктором гипоксии и бедными перинатальный исход, и есть уровень 1-доказательств в пользу его применения в управлении беременности высокого риска. ¹⁷

В этой модели, если UA AREDF наблюдается исследователь может быть уверен, что первичная операция прошла успешно в производстве тяжелой плацентарной недостаточности и что дальнейшие эхокардиографIC оценки, вероятно, будет плодотворным. Фетальной эхокардиографии недавно разветвленной от преимущественно диагностический область врожденные аномалии в настоящее время предоставляет детальную функциональную оценку функции сердца. ¹⁸ И Доплера и M-режим может использоваться для оценки плода функции желудочка и получают меры сердечного выброса. ³² Совсем недавно Роман показатели работы сердца у плода были описаны такие как спекл отслеживания и измерения деформации ^33, инфаркт индекса производительности ^{24,34, 35} тканевого допплера и трехмерной (3D) техники. ³² Важной особенностью этого настоящего исследования является то, что эти последние достижения также может быть выполнена на этом небольшом кролика модели с использованием Visualsonics VEVO 2100 microultrasound и программного обеспечения для анализа сердечной функции. Кроме того, как описано выше ¹⁴ эта модель также позволяет оценить плода гемодинамики в других сосудистых территтеорий, в частности средней мозговой артерии, венозный проток и перешейка аорты, которые широко используются в клинической практике при рассмотрении ограниченного роста плода. ³⁶ Аналогичным образом, эффектами введения глюкокортикоидов в рамках подготовки к преждевременных родов также может быть рассмотрено. ^{37, 38} Эта модель кролика предлагает дополнительные преимущества с точки зрения внутреннего контроля в противоположном рог матки, аналогичная ворсинок и hemochorial плаценты человека к беременности ^13, низкая стоимость, доступность и относительно легко обращаться.

Есть, тем не менее, некоторые ограничения этой модели, которая должна быть решена. Основным ограничением является ятрогенной брадикардия плода во время эхокардиографии. По материнской линии вводят ингаляционные изофлурана может привести к брадикардии плода ³⁹ и должны быть сведены к минимуму или, как в нашем случае не используются вообще во время эхокардиографии. Вместо этого, мы заменили это для внутривенной инфузии кетамина иксилазина, который недавно был показан на кроликов не изменять среднее артериальное давление ^40, тем самым поддержание предположительно плацентарный (и, следовательно плода) перфузии. Несмотря на такой подход, воздействие на плодное яйцо к внешней среде, обработке и давлению со стороны ультразвукового преобразователя все это может вызвать брадикардию плода временно. Опишем метод способов минимизировать этот эффект, однако для точных результатов мы считаем, эхокардиографических и фетоплацентарной доплеровского ультразвук лучше ограничена примерно 5 мин от общей экспозиции. С более сложными методами эхокардиографии и кривые обучения теперь описано в клинической литературе ^41, тщательное планирование необходимо заранее, чтобы обеспечить стандартизированные результаты. Некоторые из эхокардиографических измерений, описанных в данном исследовании, например клапанные кольцевая экскурсия систолического плоскости и спекл отслеживания с деформированным, не установлены в текущей акушерской клинической практике, несмотря на гоEIR использования во взрослой кардиологии. ^42,43 Тем не менее, учитывая недавний интерес исследования в этих новых измерений в медицине плода, мы решили включить их в нашу методологию, чтобы сообщить исследователям, что они осуществимы получить при использовании этой модели кролика. Анализ этих конкретных параметров в ЗВУР плода выходит за рамки этого методологического исследования. Другое ограничение относится к естественной тенденции у кролика для IUGR на основе положение плода ^44, поэтому хорошо перфузии яичников и вагинальный концах каждого рог рекомендуются для плода распределение случае. Кроме того, в этой методологии, гестационный возраст 25 дней используется для хирургической вызывают IUGR. Это основано на ранее описанные успешных экспериментов, однако ожидаемый уровень смертности на 50%. ^13,14 Наконец, фетальную размер исключает хронический приборов, который полезен при овец модели для размещения гемодинамические датчиков потока для последующего без эвтаназии измерений и повторитьЭд забора крови. ⁺¹¹ В заключение селективной лигатуры сосудов маточно-плацентарного производить IUGR в кролика с последующей экспертизы microultrasound сердечной функции представляет собой животную модель, которая согласуется с современной клинической практике, и поэтому полезно двунаправленный поступательных исследователей.

Автор профессор Ян D'Hooge имеет исследование соглашение с VisualSonics. Остальные авторы не имеют раскрытия информации.

Эта работа опирается на Гамильтон-Fairley NHMRC стипендий (RH, Al); операционной инфраструктуры викторианской правительства Программа поддержки (RH, EW) и Марии Кюри Industria-Академия партнерства и путей предоставляем поддержке Европейской комиссии (ME, PD) . Авторы хотели бы поблагодарить д-р Андре Miyague, доктор Франческа Руссо, г-жа Розита Kinnart и г-н Иван Laermans их богатому опыту в производстве этого видео.