Por isso, estudamos carboidratos complexos, ou glicanos, no sistema imunológico inato e distúrbios relacionados ao sistema imunológico, com foco atualmente em sepse e câncer. Nosso trabalho envolve métodos analíticos e glicobiologia de sistemas, incluindo métodos glicômicos e glicoproteômicos, para a caracterização detalhada da glicoproteína humana. A glicoproteômica experimentou enormes avanços nas últimas décadas, e o progresso não é mais limitado pela escassez de dados de espectrometria de massa de alta qualidade disponíveis.
Em vez disso, o desafio é interpretar e gerar conhecimento biológico a partir dos dados espectrais. O método de glicoproteômica guiado por glicômica permite que os cientistas de glico obtenham uma visão profunda e precisa do glicoproteoma e das barreiras rígidas com índices de saúde humana, a glicoproteômica é capaz de gerar informações específicas do local sobre o glicoproteoma. Mas as taxas de glicopeptídeos permanecem altas.
Para resolver esses problemas de reprodutibilidade, nosso método glicoproteômico permite o perfil de glicoproteoma de precisão, definindo restrições no espaço de pesquisa de glicanos por meio do levantamento glicômico da mesma amostra. Em última análise, permite pesquisas de glicopeptídeos mais rápidas e precisas. Nosso método de glicoproteômica guiado por glicômica permite um mapeamento abrangente da heterogeneidade e dinâmica dos índices de glicoproteoma de uma variedade de diferentes espécimes humanos.
Este método pode, portanto, nos ajudar a entender melhor a progressão da doença e também pode nos ajudar a encontrar novos biomarcadores diagnósticos para alvos terapêuticos contra uma ampla variedade de doenças humanas. O método glicoproteômico guiado por glicômica nos permite decifrar a complexidade do glicoproteoma humano, que, por sua vez, abre novas questões biológicas, como como as estruturas do glicano afetam a função da proteína, a comunicação celular ou as respostas imunes. Também levanta questões sobre como e por que o padrão de glicosilação mudou em certas doenças.
E esses insights podem levar a descobertas e novos marcadores diagnósticos e terapias personalizadas em doenças complexas. Para imobilizar a proteína de interesse em uma membrana de PVDF, usando uma punção de orifício único, corte a membrana com base no número de amostras a serem detectadas. Umedeça as membranas excisadas com metanol e transfira-as para uma placa de fundo plano de 96 poços.
Quando as membranas estiverem quase secas, aplique 2,5 microlitros de amostras de proteína por ponto. Seque as membranas ao ar livre a 20 a 25 graus Celsius por pelo menos três horas, ou de preferência durante a noite, tomando cuidado para evitar contaminação. Adicione 100 microlitros de 1%PDP-40 em metanol a cada poço contendo as membranas manchadas.
Agite a placa na solução PDP-40 a 20 a 25 graus Celsius. Após cinco minutos, descarte a solução de PDP-40. Em seguida, lave cada poço contendo as manchas de proteína bloqueadas com 100 microlitros de água ultrapura e agite a placa por cinco minutos.
Adicione 15 microlitros de solução de PNGase F a cada poço. Para evitar a desidratação, adicione água aos poços vazios ao redor. Feche a placa cuidadosamente com filme transparente e incube por pelo menos oito horas a 37 graus Celsius.
Após a incubação, sonice a placa por cinco minutos para ajudar as gotículas evaporadas nas laterais dos poços a se acumularem no fundo. Transfira as amostras de N-glicano liberadas para tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mililitro. Lave bem cada amostra duas vezes com 20 microlitros de água ultrapura, aspirando e combinando todas as amostras restantes nos novos tubos.
Em seguida, adicione 10 microlitros de acetato de amônio 100 milimolar pH 5 e incube as amostras por uma hora a 20 a 25 graus Celsius. Seque as amostras de N-glicano em um sistema concentrador a vácuo. Para preparar carbono de grafite poroso caseiro, ou extração em fase sólida PGC-C18, ou micro-colunas SPE, use uma seringa para conectar e transferir discos C18 em pontas de pipeta de 10 microlitros.
Pipetar uma pasta de resina PGC de 10 microlitros suspensa em 50% de metanol nas microcolunas C18 SPE. Coloque as microcolunas em tubos de 2 mililitros com adaptadores de microcentrífuga. Gire os tubos para criar microcolunas PGC-C18 SPE com uma altura aproximada de coluna de 0,5 centímetros.
Em seguida, adicione 50 microlitros de ácido trifluoroacético a 0,1%, ou TFA, em acetonitrila nas microcolunas e centrifugue a 2000 G por 60 segundos para facilitar a passagem das fases móveis pelas microcolunas. Da mesma forma, lave e condicione as microcolunas três vezes usando TFA aquoso a 0,1%. Aplicar as amostras de N-glicano em cada micro-coluna em volumes de carga de até 40 microlitros.
Gire a microcoluna após cada edição, repetindo até que toda a amostra seja carregada. Lave cada micro-coluna com 20 microlitros de água ultrapura. Transfira as microcolunas para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Para eluir os N-glicanos, adicione 40 microlitros de 0,1% de TFA em 50% de acetonitrila a cada microcoluna. Gire os tubos e combine o eluato de cada rotação. Secar os N-glicanos dessalinizados num sistema de concentradores de vácuo.
Navegue pelos dados brutos de LC-MS/MS gerados usando o software apropriado. Confirme a alta qualidade dos dados avaliando a largura de pico estreita do LC, a separação efetiva dos isômeros N-glicanos, a alta precisão do MS, a resolução e a relação sinal-ruído, juntamente com a alta eficiência de fragmentação do CID MS/MS. Identifique manualmente os N-glicanos na amostra com base na massa do precursor monoisotópico, nos padrões de fragmentação CID MS/MS e nos tempos de retenção relativos e absolutos de PGC-LC.
Para quantificação relativa de N-glicanos, gere uma lista de transição contendo a relação massa/carga do precursor monoisotópico para todos os isômeros de N-glicanos identificados. Determine a área sob os valores da curva dos cromatogramas de íons extraídos de todos os íons precursores de N-glicano. Para preparar microcolunas ZIC-HILIC-C8-SPE, usando uma seringa, conecte e transfira os discos C8 para pontas de pipeta de 10 microlitros.
Depositar uma pasta de resina ZIC-HILIC suspensa em metanol nas microcolunas C8-SPE. Coloque as microcolunas em tubos de 2 mililitros com adaptadores de microcentrífuga, garantindo que as colunas fiquem suspensas no centro. Gire para criar microcolunas de HPLC C8-SPE com uma altura aproximada de um centímetro.
Adicione 50 microlitros de metanol nas micro-colunas e centrifugue a 2000 G por 60 segundos, permitindo que as fases móveis passem pela coluna. Da mesma forma, lave as micro-colunas três vezes, cada uma com 50 microlitros de água ultrapura seguida de 50 microlitros de 1% de TFA em 80% de acetonitrila. Ressuspenda as misturas de peptídeos secos designadas para enriquecimento de N-glicopeptídeos em 50 microlitros de 1% de TFA em 80% de acetonitrila e misture bem.
Coloque as microcolunas ZIC-HILIC-C8-SPE em novos tubos de 1.5 mililitro com adaptadores de microcentrífuga. Aplicar as misturas de peptídeos ressuspensos em cada microcoluna e centrifugar a 2000 G durante 60 segundos. Colete o fluxo através de frações e reaplique cada fração na mesma microcoluna ZIC-HILIC-C8-SPE.
Em seguida, eluir o N-glicopeptídeo com a adição sequencial de 50 microlitros de bicarbonato de amônio 25 milimolares e 50 microlitros de acetonitrila a 50%. Transfira as microcolunas para novos tubos de microcentrífuga de baixa ligação de 1,5 mililitro. Para eluir sequencialmente o N-glicopeptídeo retido, adicione 50 microlitros de TFA aquoso a 0,1% nas microcolunas e centrifugue a 2000 G por 60 segundos.
Em seguida, eluir o N-glicopeptídeo com a adição sequencial de 50 microlitros de TFA aquoso a 0,1% seguido de 50 microlitros de bicarbonato de amônio 25 milimolares e 50 microlitros de acetonitrila a 50%. Colete, combine e seque os N-glicopeptídeos enriquecidos e o fluxo de peptídeos não modificados através de frações em um sistema concentrador a vácuo. A análise dos dados de N-glicômica identificou 76 isômeros de N-glicano em tecidos de câncer colorretal com 70% de glicanos complexos/híbridos, 20% de oligomanose e 10% de paucimanose.
Todas as estruturas de N-glicanos foram confirmadas com evidências espectrais, quantificadas usando valores de área sob a curva de cromatogramas de íons extraídos.
