Fluorometria Sítio-Dirigida Funcional em Células Nativas para Estudo da Excitabilidade do Músculo Esquelético

O CaV1.1, um membro dos canais iônicos dependentes de tensão, possui quatro sensores de tensão distintos. Evidências sugerem que alguns sensores de voltagem contribuem mais para a ativação do receptor de rianodina ou corrente de cálcio. Nosso objetivo é ser capaz de identificar o papel preciso de cada sensor de tensão no acoplamento excitação-contração e na ativação do canal de cálcio.

O acoplamento excitação-contração tem sido estudado desde o início dos anos 50, mas os detalhes moleculares de como esse processo ocorre ainda são desconhecidos. O recente avanço na estrutura microscópica ciro-eletrônica do canal, a caracterização da nova proteína acessória CaV1.1, a descoberta de uma variante de splicing alternativo do canal e a identificação de mutação causadora de doença reacenderam o interesse neste campo. Muitas técnicas são usadas em nosso campo, desde eletrofisiologia clássica e biologia molecular até técnicas mais novas, como microscopia crioeletrônica, simulação dinâmica molecular, degradação de proteínas direcionadas e fluorometria funcional dirigida por sítio, bem como células projetadas ou modelos animais.

Atualmente, o combustível enfrenta diversos desafios experimentais. Em um músculo esquelético, o tráfego adequado e a comunicação entre CaV1.1 e RyR1, juntamente com muitas proteínas reguladoras, são cruciais para apoiar o acoplamento excitação-contração. Os métodos para estudar diretamente essas interações proteína-proteína entre CaV1.1 e RyR1 estão ausentes ou incompletos.

O laboratório do Dr. Martin Schneider vem trabalhando no acoplamento excitação-contração há décadas, caracterizando mecanismos de detecção de tensão em CaV1.1, liberação de cálcio e eventos localizados de liberação de cálcio, conhecidos como faíscas de cálcio. Recentemente, nosso laboratório vem implementando novas técnicas ópticas para investigar várias etapas do acoplamento excitação-contração e do movimento do sensor de voltagem em células musculares adultas funcionantes. Embora isso tenha sido feito anteriormente em um sistema de expressão heteróloga, nosso protocolo agora permite rastrear mudanças conformacionais em sensores de tensão CaV1.1 durante um potencial de ação propagado em seu ambiente nativo.

Nossa nova técnica nos permitirá investigar o movimento preciso do sensor de tensão necessário para o acoplamento excitação-contração. Queremos saber qual resíduo de carga em cada S4 é crítico para sua função, ou exatamente cada translocação de S4, e tudo o que é translocação está ligado à abertura de CaV1.1 ou ativação do receptor de rianodina.