Usamos com sucesso este método para criar um modelo de camundongo que seja mais consistente com as alterações patológicas da atresia biliar. Esta técnica pode simular os sintomas de atresia biliar aguda e crônica, o que é útil para futuras pesquisas sobre o mecanismo da doença. Após o uso do anticorpo, o tempo de sobrevida dos camundongos foi prolongado e os sintomas foram aliviados, sugerindo o efeito terapêutico do anticorpo na atresia biliar.
Depois de dividir os camundongos neonatais em diferentes grupos, conforme descrito no manuscrito, pré-trate cada camundongo com uma injeção intraperitoneal de cinco microgramas de anticorpo anti-Ly6G quatro horas antes da injeção de rotavírus rhesus ou RRV para esgotar as células Gr1-positivas. Dentro de 24 horas após o nascimento, injetar intraperitonealmente o camundongo neonatal com 20 microlitros de rotavírus rhesus ou soro fisiológico. Após a injeção de RRV, administrar 20 microgramas de anticorpo anti-Ly6G no abdómen do rato.
Verifique e registre a aparência, peso e sobrevivência de todos os ratos diariamente. Para injeção intraperitoneal, exponha o abdômen do rato jovem beliscando a pele do pescoço com o dedo indicador e polegar de uma mão e segurando suavemente as patas traseiras do rato com o dedo anelar e o dedo da cauda. Levante a agulha da seringa numa inclinação ascendente e introduza a agulha na coxa média da perna traseira direita do rato num ângulo de 15 graus com a pele.
Ao mover a agulha ao longo do trajeto subcutâneo até atingir a borda costal direita do camundongo, direcione a agulha para baixo na cavidade abdominal e injete o líquido sob o fígado do camundongo. Puxe a agulha imediatamente após a injeção. Observe se há sangramento ou vazamento no local da injeção.
Após anestesiar o camundongo no 12º dia, dissecá-lo ao microscópio. Insira uma seringa de insulina de um mililitro no ventrículo esquerdo do coração para coletar sangue. Centrifugar o sangue a 400 g durante cinco minutos à temperatura ambiente e separar o soro para medições da função hepática.
Disseque o fígado e o baço de camundongo dos tecidos circundantes usando tesoura e pinça. Fotografe a aparência geral do fígado e do ducto biliar. Após a anestesia inalatória, expor o fígado, a vesícula biliar e os ductos biliares extra-hepáticos com tesoura e cotonetes.
Sob um microscópio de postura, injete cinco a 10 microlitros do corante fluorescente Rodamina 123 na vesícula biliar com uma seringa de insulina de um mililitro e tire fotos. Mergulhe o tecido hepático fresco de camundongos em formalina a 10% por 24 horas. Uma vez que o tecido está incluído em parafina, use um micrótomo de parafina para cortar o bloco de parafina em cortes com uma espessura de quatro micrômetros e coloque dois cortes consecutivos na mesma lâmina.
Em seguida, coloque as fatias em uma prateleira de fatiamento, desencrefe-as em xileno e hidrate-as sucessivamente em etanol absoluto, etanol 95%, etanol 80%, etanol 70% e água destilada por cinco minutos cada. Manchar os cortes com solução de hematoxilina por cinco minutos e embeber-os em ácido clorídrico a 1% e álcool a 75% por cinco segundos. Depois de enxaguar as seções com água limpa, manche-as com solução de eosina por um minuto.
Preparar os cortes de tecido para coloração, como demonstrado anteriormente, e realizar o reparo do antígeno com tampão Tris-EDTA. Aqueça as seções em um forno de micro-ondas a 95 graus Celsius por 10 minutos, depois retire-as e resfrie-as naturalmente à temperatura ambiente. Para remover a peroxidase endógena, colocar os cortes de tecido em peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos e tratar as fatias com soro de cabra a 5% para bloquear a ligação inespecífica.
Em seguida, adicione citoqueratina 19 primária de rato anti-rato ou anticorpo monoclonal F4/80 anti-rato às secções e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Incubar as secções com anticorpos secundários apropriados durante 30 minutos à temperatura ambiente. Use 3,3-prime-diaminobenzidina como agente cromogênico para observar a reação cromogênica ao microscópio.
Observe os cortes em microscópio de 40x para obter imagens e analisá-las conforme necessário. Uma vez preparados os cortes teciduais e contracorados com hematoxilina, cubra cada tecido com 50 microlitros de solução corante vermelho sirius à temperatura ambiente por uma hora. Seque as lâminas naturalmente à temperatura ambiente por quatro horas, adicione uma gota de goma neutra a cada lâmina e use uma tampa para cobrir o tecido para evitar bolhas.
Deixe as lâminas em temperatura ambiente por 24 horas para solidificar a goma neutra. Observe os detalhes da deposição de colágeno usando microscopia de luz de contraste polarizado. Selecione um campo de visão claro e adequado e ajuste o brilho e o equilíbrio de branco do campo visual do microscópio.
Obter imagens e analisá-las conforme necessário em um microscópio de 40x. Após a injeção de RRV, a mediana do tempo de sobrevida no grupo RRV foi de 13 dias. A maioria dos camundongos tratados com o anticorpo desenvolveu icterícia leve e nenhuma perda de peso foi observada.
Os fígados de camundongos BA apresentaram lesões necróticas e um segmento extra-hepático de atresia de ductos biliares. O tamanho do fígado é menor do que os controles. A análise histológica mostrou que a terapia com baixas doses de anti-Ly6G diminuiu a inflamação da veia porta.
Acúmulo de células inflamatórias ainda foi observado nos cortes de tecido hepático no 42º dia. No 12º dia, houve discreto aumento da deposição de colágeno na região portal. No 42º dia, a expressão de colágeno aumentou significativamente, e deposição substancial de colágeno foi observada no tecido BA.
As células positivas para CK19 foram observadas no 12º dia. No 42º dia, as células positivas para CK19 aumentaram, mas havia poucos ductos biliares maduros. O ducto biliar extra-hepático em camundongos BA crônicos estava bloqueado e apresentava infiltrados inflamatórios de micrófagos.
Os níveis de ALT e FA no fígado foram maiores no grupo BA crônica do que no grupo controle normal. Os níveis de bilirrubina total, bilirrubina direta e bilirrubina indireta estavam aumentados, indicando que a função hepática estava significativamente reduzida na fase de fibrose crônica da AB. A injeção deve ser feita com cautela para não perfurar o fígado de camundongo. Após a injeção, devemos levar cerca de 10 segundos para observar o estado do rato e limpar o sangue da ferida.
