Espécies de Plantago podem ser utilizadas como plantas modelo para biologia vascular vegetal e fisiologia do estresse. O estabelecimento de um protocolo de transformação permite estudos aprofundados sobre essas plantas para explorar as relações entre genes e seu fenótipo associado. A principal vantagem dessa técnica é que ela utiliza alimentos como explantes para transformar banana-da-terra de folha estreita com alta eficiência.
Para começar, coloque sementes de Plantago lanceolata selvagens disponíveis comercialmente em um tubo centrífugo de 50 mililitros até a marca de 5 mililitros, dependendo do número de plantas desejadas. Imergir as sementes em etanol 75% por 60 segundos. Após o descarte do etanol, imergir as sementes em hipoclorito de sódio a 20% recém-preparado por 40 minutos, invertendo suavemente o tubo.
Sob uma capela de fluxo laminada, descarte a solução de hipoclorito de sódio e, em seguida, lave as sementes cinco vezes com água destilada. Adicione um pequeno volume de água às sementes após o enxágue final, pois isso pode ajudar a auxiliar o movimento das plantas em placas. Com pinças estéreis, transferir as sementes para uma placa de Petri pré-preparada com meio MS sólido, espalhando as sementes uniformemente pela superfície da placa, aproximadamente 1 centímetro entre cada semente para evitar a superlotação das plântulas germinantes.
Sele a placa com duas camadas de filme de parafina para evitar a contaminação e incube sob uma luz de crescimento branca fria à temperatura ambiente. Uma vez que as plântulas germinam e são grandes o suficiente para serem transferidas, normalmente após dois ou três dias de germinação, use pinças estéreis e transfira as mudas para caixas estéreis contendo 50 a 100 mililitros de meio MS. Sele as caixas com fita cirúrgica e deixe as plantas crescerem sob a luz branca fria por cerca de três a quatro semanas.
Streak Agrobacterium tumefaciens contendo o plasmídeo desejado em uma placa LB sólida preparada com o agente de seleção apropriado. Incubar a placa selada em parafina a 28 graus Celsius por até 48 horas, ou até que a bactéria cresça o suficiente para pegar. Após a incubação, Escolher uma colônia de bactérias usando uma ponta de pipeta dois dias antes da transformação e inocular-a em um tubo de fundo redondo de 15 mililitros contendo seis mililitros de LB líquido com o agente de seleção apropriado.
Agite a 200 RPM em um agitador de mesa de 28 graus Celsius, durante a noite, até que o OD 600 atinja 0,6 a 0,7. Uma vez que as bactérias atinjam a DO necessária, transfira 200 microlitros da cultura bacteriana para um frasco estéril contendo 100 mililitros de LB com o agente de seleção. Agite a 200 RPM a 28 graus Celsius, durante a noite.
Em seguida, transfira a cultura bacteriana para tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros e centrifuja a 2.200G por 10 minutos à temperatura ambiente para coletar as bactérias. Eliminar o sobrenadante e voltar a suspender o pellet bacteriano em cinco mililitros de solução de suspensão recém-preparada ou SS à temperatura ambiente por pipetagem. Em seguida, adicione mais SS até a marca de 50 mililitros e inverta para misturar várias vezes.
Assim que as plantas atingirem o estágio ideal para transformação, em cerca de três semanas, utilize pinças e tesouras estéreis para separar as raízes da planta e descartar o material foliar e caulinar. Imediatamente após o corte, transfira assepticamente os pedaços de raiz para caixas contendo água estéril usando pinças para mantê-los hidratados. Em seguida, despeje a cultura bacteriana SS suspensa de Agrobacterium tumefaciens em placas de Petri descartáveis estéreis de 150 por 15 milímetros.
Transfira as raízes cortadas para a cultura bacteriana e incube por pelo menos 20 minutos. Durante a incubação, use um bisturi estéril com uma lâmina afiada para cortar as raízes em fragmentos de um centímetro separando as raízes primárias das raízes laterais. Em seguida, faça cortes finos e rasos na superfície das raízes para permitir que as bactérias infectem a planta.
Após a incubação, transfira os pedaços de raiz para toalhas de papel estéreis para remover o excesso de bactérias. Em seguida, transfira as raízes secas para as placas de Petri preparadas contendo meios sólidos de co-cultura, em torno de 10 a 20 raízes por placa, dependendo do tamanho das raízes. Sele as placas com duas camadas de filme plástico transparente e depois com papel alumínio para incubar em temperatura ambiente por três dias.
Após três dias de incubação. No meio de co-cultura, transferir os pedaços de raiz para placas de Petri preparadas com meio sólido de indução da parte aérea ou SIM com 500 miligramas por litro de temetina e seleção antibiótica adequada. Incubar as placas seladas de filme plástico transparente sob uma luz de crescimento por um mês ou até que os brotos comecem a emergir.
Uma vez que as plântulas crescem 1,5 a 2,0 centímetros de comprimento. Transfira-os para caixas estéreis preparadas. Com indução radicular sólida.
Cultivar as plantas sob uma luz de crescimento por várias semanas até que as raízes se formem. Normalmente, após uma semana, quando os sistemas radiculares se tornam grandes o suficiente para transferir normalmente após um mês de crescimento, pegue a planta e lave suavemente as raízes com água para remover qualquer meio que grude nas raízes. Em seguida, transfira as plantas para vasos quadrados de 3,5 polegadas contendo solo pré-molhado para todos os fins BM sete cubra as plantas com uma tampa plástica de vaso e, em seguida, com um saco plástico transparente para garantir que as plantas permaneçam em um ambiente úmido.
Este método foi testado na raiz, folha e pequeno tecido velho. No experimento preliminar, embora calos pudessem ser induzidos em todos os tipos de tecidos, apenas o tecido radicular produziu iniciais da parte aérea após um mês no SIM, a folha e o pedal ficaram marrons e morreram. A progressão das iniciais dos brotos emergindo do tecido transformado foi observada desde o primeiro dia.
As raízes foram colocadas no SIM até quando os brotos estivessem prontos para serem enraizados. Após uma semana, o tecido radicular formou um calo no início das iniciais dos brotos. Os brotos continuaram a emergir durante as semanas dois e três e, após quatro semanas, os brotos estavam prontos para serem transferidos para o meio de indução radicular.
A identificação das plantas transgênicas punitivas foi realizada por meio do ensaio histoquímico de beta glucuronidase GUS utilizando os segmentos foliares retirados uma vez que a parte aérea tinha cerca de 0,5 centímetros de comprimento. O tipo selvagem em transformação com vetores vazios não apresenta padrão de coloração. Devido à ausência do gene GUS, a transformada com o gene da beta glucuronidase GUS apresentou um padrão de coloração azul claro nas nervuras confirmando que as plantas são transgênicas As raízes devem ser sempre mantidas hidratadas para evitar o ressecamento durante o procedimento transferir as raízes aproximadamente 10 de cada vez para evitar isso.
