Nosso protocolo explica como projetar, construir e analisar circuitos digitais de genes de levedura que fazem uso de sistemas de dCas CRISPR tipo dois e tipo cinco e as proteínas anti-CRISPR correspondentes. É a montagem porque reúne zero procedimentos padrão para montar e testar redes transcricionais sintéticas em serviços. Para começar, prepare uma mistura de reação contendo 20 a 40 nanogramas de molde de DNA, um microlitro de primer direto, um microlitro de primer reverso, cinco microlitros de mistura DNTP, 0,5 microlitros de DNA polimerase, 10 microlitros de tampão de reação de DNA polimerase 5x e água bidestilada até um volume total de 50 microlitros.
Amplificar as sequências de DNA usando o programa de PCR touchdown em um termociclador conforme descrito no manuscrito. Isolar os produtos da PCR por eletroforese em gel e diluir as sequências de DNA do gel de agarose através de um kit de extração em gel de DNA. Usando o método de montagem de Gibson, insira os produtos de PCR purificados no vetor de vaivém aberto cortado, deixando entrar a mistura de DNA equimolar a 50 graus Celsius por uma hora.
Construa o vetor aceitador dCas12a via PCR touchdown e o método de montagem Gibson, conforme demonstrado anteriormente. Inserir as proteínas dCas12a otimizadas para o códon de levedura nos dois vetores aceptores recém-construídos via digestão com BamH1 e Xhol1 e ligadura com T4 DNA ligase. Similarmente, construir os plasmídeos com base no vetor de vaivém pRS2403 para expressar as proteínas anti-CRISPR via touchdown PCR e o método de montagem de Gibson.
Para realizar a detecção de células de microscopia, coloque dois microlitros da solução celular em uma lâmina de vidro e cubra-a com uma lamínula. Observe as células sob um microscópio de fluorescência, ligando a fonte de luz fluorescente, o microscópio e o computador. Depois de anotar o número da fonte de luz fluorescente, abra o software do microscópio no computador.
Coloque a lâmina no palco do microscópio e escolha a lente objetiva de 40x enquanto observa as células sob a luz verde. Mova o botão de foco do curso até que o contorno das células de levedura apareça e o botão de foco fino para focar as células. Para detectar as células, depois de fechar o campo de visão do microscópio mudar para a tela do computador e clique em ao vivo.
Aguarde de três a cinco segundos. Clique na captura para tirar uma foto e salvá-la. Em seguida, desligue o computador, o microscópio e a fonte de luz fluorescente.
Ligue a máquina FACS 20 minutos antes das medições para aquecer o laser e misture 20 microlitros da cultura celular com 300 microlitros de água bidestilada. Execute o software FACS no computador conectado à máquina FACS e crie um novo experimento. Em seguida, defina os parâmetros de medição.
Em seguida, selecione o filtro de acordo com os comprimentos de onda de excitação e emissão das amostras e defina o número da célula de aquisição como 10.000. Ajuste a tensão do filtro FITC medindo a intensidade das esferas fluorescentes, garantindo que a diferença relativa na intensidade das contas entre dois experimentos consecutivos não exceda 5%Lave a máquina com água destilada dupla por alguns segundos para remover qualquer possível excesso de contas. Meça a intensidade da fluorescência da amostra e clique na visualização enquanto aguarda de três a cinco segundos para a estabilidade da injeção da amostra.
Por fim, clique em adquirir. Meça as contas novamente no final do experimento. Depois de verificar se a diferença relativa entre as duas medidas de contas excede 5%Exporte os dados FACS como arquivos FCS.
Abra o R studio e carregue o script BDverse_analysis. R para analisar os arquivos FCS. Defina o nome do experimento como ename, o caminho do diretório onde os arquivos FCS são armazenados como dir_d e os arquivos de resultado serão criados como dir_r.
Em seguida, defina o canal de fluorescência. Defina o número de amostras que foram medidas. As dimensões dos gráficos de pontos e o comprimento máximo dos eixos x e y para gráficos de barras e gráficos de caixa.
Escolha o método de classificação removendo a hashtag das linhas correspondentes. Selecione o objeto flowSet fechado correspondente ao método de gating escolhido e a resolução do gráfico de pontos, que deve ser pelo menos igual a 256. Descomente as duas instruções de filtragem para remover medidas onde a fluorescência é negativa e para remover outliers devido a outros experimentos, conforme descrito no manuscrito.
Pressione o código-fonte e execute o script. Todos os arquivos contendo os resultados da análise são criados em dir_r. A melhor eficiência de ativação de dSpCas9-VP64 foi alcançada quando havia seis locais-alvo de lexOp no promotor sintético.
Enquanto para dCas12a-VPR maior eficiência de ativação quando três cópias de lexOp foram inseridas no promotor sintético. A ativação por RNA CRISPR e RNA guia único localizado em um plasmídeo integrativo foi 1,4 a 2,4, e 1,1 a 1,5 vezes maior do que quando colocado em um plasmídeo epissomal. Os resultados da RT-qPCR mostraram que um vetor epissomal produziu um nível muito maior de RNA guia único CRISPR do que o vetor integrador, independentemente do sistema de expressão.
A eficiência de ativação do complexo dSpCas9 e do recrutamento de RNA de andaime MCP-VP64 foi testada. O RNA do andaime contendo um único tipo selvagem e hairpin F6MS2 deu uma ativação de 5,27 e 4,3 vezes, respectivamente. No entanto, a combinação dos dois pinos resultou em 7,54 vezes com a maior eficiência de ativação.
Quatro promotores diferentes foram usados para conduzir a expressão de três tipos de tipo dois anti CRISPR, mostrando que eles funcionavam de maneira dependente da dose. Um promotor forte reduziu o nível de fluorescência para 0,21, 0,11 e 0,13 de seu valor, respectivamente. A curva de titulação mostra que o circuito se comporta como uma marcha de nó com uma relação liga/desliga próxima de 2,3.
O tipo cinco anti-CRISPR A reduz a expressão de fluorescência de ambos denAS-Cas12a e dLB-Cas12a como ativadores de 19% para 71%A relação entre ativadores e repressores foi estudada onde o Acr-VA exibiu grandes flutuações em seu desempenho quando produzido por pGAL1 sob pTEF1 e o genético CYC1t-pCYC1noTata tipo cinco anti-CRISPR-A1 mostrou alguma repressão apenas no dLB Cas12a nu. A máquina FACS é frágil, portanto deve ser manuseada com cuidado. A solução celular nunca deve ser demasiado densa e a máquina deve ser mantida limpa.
