Este método nos permitirá isolar as partículas do vírus Epstein Barr da linhagem celular P3HR1 e quantificar o estoque de vírus para que ele possa ser usado para vários fins de pesquisa. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um método relativamente fácil, barato, rápido e confiável para preparar um estoque viral EB. As partículas vitais produzidas por esta técnica podem ser usadas em muitos modelos experimentais in vitro ou in vivo para o diagnóstico de EB.To começar, preparar um volume de suspensão celular A em um tubo cônico de 15 mililitros, ajustar o volume de tal forma que o número de células seja de aproximadamente 2,2 milhões de células para uma placa de cultura de 100 milímetros.
Adicione cinco mililitros de meio de cultura completo ao tubo. Adicione 80 microlitros de dimetilsulfóxido ao tubo. Em seguida, adicione 350 microlitros de um miligrama por mililitro de PMA ao tubo.
A concentração final de PMA deve ser de 35 nanogramas por mililitro, e a de DMSO deve ser de 0,08%Adicione 4,27 mililitros de meio de cultura para que o volume total seja de 10 mililitros. Misture o conteúdo do tubo inclinando-se e, em seguida, transfira o conteúdo para uma placa de cultura de 100 milímetros. Deixe a placa em uma incubadora de cultura de células por cinco dias a 37 graus Celsius, dióxido de carbono a 5%.
Após cinco dias na incubadora, centrifugar o conteúdo da placa a 120 G durante oito minutos para peletizar as células Recolher o vírus livre de células que contém sobrenadante e eliminar o pellet celular. Novamente centrifugar o sobrenadante a 16.000 G por 90 minutos a quatro graus Celsius para peletizar as partículas do vírus. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet do vírus em cinco mililitros de meio de cultura, Aliquote a suspensão viral em 20 tubos cada um contendo 250 microlitros da suspensão viral e armazene a suspensão a menos 80 graus Celsius.
Para separar as proteínas do DNA, adicione 500 microlitros de fenol saturado de Tris a um dos tubos que contêm a preparação viral. Adicione 100 microlitros de água e poço de vórtice para obter uma emulsão rosa. Centrifugar por 15 minutos a 9.650 G, coletar o sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Adicionar um equivalente a um décimo do volume sobrenadante de acetato de sódio frio e misturar pipetando para cima e para baixo. Em seguida, adicione um microlitro de 20 miligramas por mililitro de glicogênio e misture por pipetagem. Adicione três vezes o volume de etanol frio do sobrenadante e armazene-o a menos 80 graus Celsius durante a noite.
Para isolar a centrífuga de DNA viral a 9, 650 G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante para obter um pellet de DNA e lave o pellet três vezes com um mililitro de etanol frio a 70%. Novamente centrifugar a 9.650 G por 15 minutos e descartar o sobrenadante.
Após secar o pellet ao ar por cerca de 10 minutos, ressussuscite o pellet em 10 a 50 microlitros de água destilada livre de nuclease. Armazenar as amostras a menos 20 graus Celsius para processamento posterior ou a quatro graus Celsius durante a noite para garantir a dissolução máxima do DNA, seguida de armazenamento a menos 20 graus Celsius. Depois de limpar o pedestal de um micro espectrofotômetro com um delicado limpador de tarefas, carregue um microlitro da amostra de DNA preparada e observe a concentração do DNA na amostra.
Verifique as proporções de absorbância em 260 a 280 nanômetros e 260 a 230 nanômetros. O DNA absorverá a 260 nanômetros, as proteínas a 280 nanômetros e substâncias orgânicas, como o fenol, absorverão a 230 nanômetros. Uma razão de 1,8 para 2 é considerada suficiente para a PCR em tempo real.
Para preparar as misturas de reação de PCR, coloque cinco microlitros de uma mistura de PCR em tempo real verde cibernético em tubos de PCR de 0,2 mililitros. Adicione um microlitro de 7,5 moles de pico por primer dianteiro de microlitro e um microlitro de 7,5 moles de pico por microlitro de primer reverso a cada tubo. Aqui, o gene EBV de pequeno RNA 2 é amplificado.
Para determinar o número de cópia do genoma do EBV. Em seguida, adicione dois microlitros de água livre de nuclease e um microlitro de DNA viral a um dos tubos. O volume total da mistura de reação é de 10 microlitros.
Prepare outros tubos que serão usados como padrões com números de cópia do genoma do EBV conhecidos. Execute as misturas de PCR começando com uma etapa inicial de ativação a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, 40 ciclos a 95 graus Celsius por 15 segundos e a 58 graus Celsius por 30 segundos.
Exporte todas as folhas de dados como arquivos CSV e calcule o log do número de cópias do genoma do EBV por tubo padrão e os valores médios de CQ. Gere uma curva padrão de qPCR plotando os valores de TC dos padrões em relação ao log do número de cópias do genoma. Empregando a equação de gráfico de curva padrão, derive o número de cópias do genoma do EBV no tubo de PCR contendo o DNA viral induzido.
Finalmente, use a fórmula mostrada na tela para calcular a concentração da preparação viral induzida. Aqui X é o número de cópias do genoma do EBV derivadas da curva padrão, e F é o fator de diluição usado para configurar o DNA por reação de PCR. A contagem de células usando uma câmara de hemocitômetro é mostrada aqui.
Quatro quadrantes são contados usando um microscópio de luz. Aqui, as células indicadas em azul devem ser contadas, enquanto as células em vermelho não devem ser contadas, uma vez que estão tocando as bordas superior, direita, inferior ou esquerda do quadrante. Um ensaio de otimização foi realizado para determinar as concentrações de PMA e dimetilsulfóxido que produziriam o maior número de partículas de EBV.
Uma concentração de DMSO de 0,8% e uma concentração de PMA de 35 nanogramas por microlitros foram ótimas e resultaram em altas concentrações de EBV. Nosso laboratório usou as partículas vitais produzidas por esta técnica para examinar as respostas pró-autoimunes ou inflamatórias a este vírus. Bem como para desenvolver novos agentes anti-EBV.
