Meu laboratório é especializado em modelagem de tumores tridimensionais. Modelos de esferoides tumorais são amplamente utilizados ao longo da biologia e descoberta de drogas. No entanto, os protocolos existentes para coletar dados desses experimentos são caros, difíceis e limitados.
Este protocolo requer produtos químicos e equipamentos de fácil acesso, e não é muito trabalhoso em comparação com métodos atuais que fornecem resultados semelhantes. Este protocolo foi desenvolvido para ser relativamente fácil de implementar para iniciantes e robusto para pequenos erros, já que muitas das etapas são reversíveis. Comece pesando 0,5 gramas de agarose de baixo derretimento em uma garrafa de vidro.
E adicione 25 mililitros de PBS. Derreta a agarose fervendo a solução em um micro-ondas por 30 a 60 segundos com a tampa fechada, e redemoinhos constantes. Pese nove gramas de N, N, N'N'Tetrakis(2-hidroxipropyl)etilenediamina, 22 gramas de ureia, 44 gramas de sacarose, 0,1 gramas de Triton X-100 e 24,9 gramas de água deionizada.
Aqueça a solução em um banho de água de 56 graus Celsius com mistura constante. Depois que os cristais forem dissolvidos, descanse a solução à temperatura ambiente para permitir que as bolhas se formem durante a mistura, subam à superfície. Gerar esferoides usando o método de sobreposição de agarose descrito no manuscrito do texto.
Corte a ponta de uma ponta de pipeta de um mililitro usando um bisturi para ampliar o orifício. Usando a pipeta, aspire os esferoides dos poços e transfira-os para um tubo cônico claro de 1,5 mililitro. Vários esferoides das mesmas condições podem ser combinados no mesmo tubo.
Lave os esferoides duas vezes em um mililitro de PBS, depois adicione uma solução de paraformaldeído neutro de 4% pré-aquecida e incuba os esferoides a 37 graus Celsius. Após 20 minutos, remova a solução de paraformaldeído e lave os esferoides duas vezes com um mililitro de PBS. Em seguida, para coloração, transfira até 15 esferoides em um tubo PCR de 200 microliter, usando uma pipeta.
Permeabilize as células usando 200 microlitrais de 0,5% Triton X-100 em PBS. Coloque os tubos PCR dentro de 50 mililitros, tubos de tampa de parafuso e cubra o tubo com papel alumínio e incubar os esferoides à temperatura ambiente com leve agitação. Após duas horas, substitua a solução por 200 microliters de tampão de diluição de anticorpos e incubar durante a noite à temperatura ambiente.
No dia seguinte, remova o tampão de diluição de anticorpos antes de adicionar 75 microlitadores de anticorpos primários e incubar a quatro graus Celsius por dois dias e meio. Após a incubação, remova o supernascer e lave os esferoides duas vezes com 200 microliters de PBS, contendo 0,1% Tween e 0,1%Triton X-100 ou PBS-TT. Em seguida, incubar com 200 microliters de PBS-TT por quatro horas em temperatura ambiente.
Em seguida, remova o PBS-TT antes de adicionar 100 microlitadores do anticorpo secundário e incubar a quatro graus Celsius por dois dias e meio. Após a incubação, remova o supernascer e lave duas vezes com PBS-TT, antes de incubar com 200 microliters de PBS-TT por quatro horas. Para montagem, use uma pipeta de 200 microliter, transfira esferoides fixos e manchados para 500 tubos PCR microliter, a um tubo por condição.
Substitua a solução por 200 microliters de gel de agarose 2% líquido, e centrífuga no giro rápido, na velocidade máxima fixa, em temperatura ambiente, por 30 segundos. Aspire os esferoides em 50 microliters de gel líquido agarose e dispense no poço de uma placa inferior de vidro de 24 poços. Antes que o gel endureça, separe os esferoides usando uma ponta de pipeta no gel circundante e certifique-se de que os esferoides estejam cobertos com gel.
Em seguida, submergir o gel adicionando 500 microliters de solução de compensação por poço, e incubar à temperatura ambiente, no escuro, por 24 horas antes da imagem. Para a imagem, escolha um objetivo com uma distância de trabalho tempo suficiente para abranger todo o esferoide, incluindo a altura de montagem do esferoide no vaso. Para identificar o plano equatorial, ajuste o foco até que a maior área de superfície seja atingida no plano XY, e imagem com a porcentagem de energia laser necessária, tensão do detector, ganho e configurações de deslocamento.
Para imagens tridimensionais, defina o início e o fim dos esferoides e escolha a intensidade de sinal apropriada em várias profundidades Z, usando configurações de correção de intensidade Z. Este estudo mostra uma comparação dos esferoides de melanoma humano FUCCI limpos e não claros, em comparação com os esferoides montados na PBS. A solução de compensação fornece imagens de alta clareza com distorção de tamanho mínimo.
A solução de compensação permite ainda imagens de alta resolução de detalhes de nível celular mais profundas nos esferoides sem seção histológica. Com imagens confocal tridimensionais, podem ser obtidos detalhes do nível celular a uma profundidade de 200 mícrons. Além disso, é mostrada uma comparação entre o esferoide de buracos criosectionados e limpos, manchado para pimonidazol e p27kip1.
A coloração do pimonidazol mostra a região hipóxica do esferoide, e a coloração p27kip1, marca a prisão do ciclo celular e a mancha nuclear DAPI. Penetração mais profunda e menos dispersão, permitem uma melhor representação da estrutura esferoide tridimensional com perda mínima de luz. A renderização tridimensional dos esferoides FUCCI, manchada com DRAQ7, é mostrada.
A solução de compensação tem impacto mínimo no tamanho do esferoide. O diâmetro do esferoide foi definido com base em uma esfera com a mesma área transversal do esferoide. Os esferoides foram observados para um leve aumento de tamanho nas primeiras seis horas, como indicado por uma variação de dobra de diâmetro entre 2% e 6% Em contraste, após 24 a 72 horas, os esferoides voltaram a um tamanho aproximadamente igual ao tamanho correspondente na fixação pós-paraformaldeído pbs.
É importante esperar pelo menos 24 horas antes da imagem, para deixar a solução de compensação equilibrar com os esferoides e o gel. Este protocolo permite que os praticantes coletem rapidamente dados de um grande número de esferoides, permitindo uma análise matemática e estatística quantitativa detalhada que fornece insights detalhados sobre a biologia.
