Nosso protocolo descreve um método simples e confiável para um ensaio de ressorção osteoclástica. O uso de placas de cultura celular revestida de fosfato de cálcio pode ser facilmente preparado e visualizado usando materiais disponíveis em laboratório. Em contraste com as fatias opacas de osso ou dentina, o revestimento de fosfato de cálcio permite a visualização de poços de ressorção e células ao mesmo tempo.
Neste protocolo, usamos PBMCs para diferenciação osteoclasta. No entanto, também pode ser aplicado a outros tipos de células, como monócitos derivados da medula óssea ou células Raw 264.7. Primeiro pegue uma placa de cultura de células de fundo plano 96 e pipeta 300 microliters de solução de fosfato de cálcio previamente preparada em cada poço.
Em seguida, cubra a placa com a tampa e incubar a placa a 37 graus Celsius por três dias. Após três dias, aspire a solução de pré-calcificação a partir das placas de cultura celular pré-calcificadas de 96 poços e adicione 300 microliters de solução de fosfato de cálcio a cada poço. Cubra as placas com uma tampa e incubar a 37 graus Celsius por um dia.
Em seguida, inverta a placa para derramar a solução e lave bem a placa três vezes com água desionizada. Seque imediatamente a placa usando um secador de cabelo ou dióxido de carbono comprimido ou gás nitrogênio para manter uma superfície uniforme. Agora, irradie a placa revestida em um banco limpo com raios ultravioletas por uma hora.
Use a placa revestida imediatamente ou sele a placa com Parafilm e armazene-a em temperatura ambiente. Diluir 15 mililitros de sangue fresco com um volume igual de PBS e misturá-los invertendo ou pipetando várias vezes. Em seguida, pegue 15 mililitros de solução gradiente de densidade em um tubo cônico de 50 mililitros, incline o tubo e coloque cuidadosamente 30 mililitros de amostra de sangue diluído nos 15 mililitros da solução de gradiente de densidade.
Mais tarde, centrifufique o tubo em um rotor de balde balançando sem quebrar a 810 vezes G por 20 minutos a 20 graus Celsius. Em seguida, aspire a camada superior deixando a camada de célula mononuclear intacta na interface. Transfira cuidadosamente a camada da célula mononuclear para um novo tubo cônico de 50 mililitros.
Encha o tubo com PBS, misture e centrífuga a 300 vezes G por 10 minutos a 20 graus Celsius. Suspenda os PBMS em um ALFA-MEM completo contendo 20 nanogramas por fator estimulante da colônia de macrófagos mililitros, e sementes 2,5 vezes 10 às quintas células por centímetro quadrado PBMCs em um frasco. Incubar as placas revestidas de fosfato de cálcio com 50 microliters de soro bovino fetal a 37 graus Celsius por uma hora.
Em seguida, lave o frasco duas vezes com PBS para separar os precursores osteoclantes de células mortas ou não aderentes, em seguida, adicione quatro mililitros de trippsina por frasco de 75 centímetros quadrados. Após 30 minutos, pare a digestão adicionando quatro mililitros de alfa-MEM completo, em seguida, desprende cuidadosamente as células usando um raspador de células. Transfira as células para um tubo de 50 mililitros e conte o número total de células usando uma câmara de contagem.
Centrifugar o tubo a 350 vezes G durante sete minutos para pelotar as células e reutilizar a pelota e mem alfa completo contendo M-CSF e RANKL para obter uma vezes 10 para as seis células por mililitro. Aspire o soro bovino fetal da placa revestida de fosfato de cálcio, e pipeta 200 microliters de suspensão celular por poço. Após a incubação, lave as células duas vezes com PBS.
Fixar as células com 4% de paraformaldeído por 10 minutos e lavar novamente com PBS. Para coloração, adicione o tampão de permeabilização às células fixas e incuba-as por cinco minutos. Para manchar os filamentos de actina, incubar as células com 100 microliters de Alexa Fluor 546 rotulada solução de faloideina na PBS por 30 minutos, em seguida, aspirar a solução de coloração e manchar os núcleos usando 100 microliters de Hoechst por 10 minutos.
Colorir o revestimento de fosfato de cálcio com 100 microliters de 10 micromolars de calceína e PBS por 10 minutos. Depois de lavar três vezes com PBS, capture imagens. Para Von Kossa, a coloração do revestimento de fosfato de cálcio adiciona 50 microliters de 5% de nitrato de prata e água desionizada a cada poço, e incuba a placa sob radiação ultravioleta por uma hora até que o revestimento na parte inferior dos poços fique marrom.
O revestimento de fosfato de cálcio na parte inferior das 96 placas pareciam ser uniformes e bem aderidos. Após nove dias de cultura em M-CSF e RANKL nas placas revestidas de fosfato de cálcio, precursores de osteoclato formaram poços de resorção e grandes osteoclartos. Os osteoclastas multinucleados localizados nos poços expressaram altos níveis de TRAP.
Os osteoclastos maduros mostraram a presença de três ou mais núcleos e o anel de actina distinto. O revestimento de fosfato de cálcio verde mostrou a presença de poços de resorção preto. As imagens de fluorescência da área do poço foram medidas utilizando-se a ferramenta de limiar de imagem J.O número e o tamanho dos osteoclatos foram calculados utilizando-se o gerente do ROI e a ferramenta de seleção de polígonos dos precursores da imagem J.Osteoclasts cultivadas na ausência de RANKL não conseguiam formar poços de resorção, porém M-CSF e RANKL facilitaram a formação de poços osteoclastogênicos.
E a área do poço foi quantificada usando imagem J.Imediatamente secando a placa revestida com fluxo de ar ajuda a fazer um revestimento uniforme de fosfato de cálcio. Caso contrário, é propenso a formar um revestimento mais grosso no meio do poço.
