Este protocolo fornece uma ferramenta significativa para estudar as interações entre as células imunes intestinais e o epitélio e dissecar como essas interações podem regular na homeostase intestinal e inflamação. A principal vantagem dessa técnica é a requintada quantidade de controle experimental facilitada pela redução do modelo in vitro, que pode ser usado para abordar questões em biologia epitelial e imunológica. Este sistema já foi usado para determinar o papel do ILC1 na expansão de criptas epiteliais CD44 positivas e tem o potencial de avançar ainda mais nossa compreensão de doenças gastrointestinais mediadas por inflamação.
Para começar, coloque a matriz extracelular basal transversal térmica no gelo para descongelar e pré-aquecer uma placa padrão tratada com cultura de tecido 24 poços, colocando-a em uma incubadora de 37 graus Celsius. Depois, remova a placa contendo organoides da incubadora e descarte a mídia do poço a ser passagem. Em seguida, adicione 500 microliters de DMEM F12 avançados de gelo aos poços, e usando uma ponta P-1000, colde os organoides de todos os poços em um tubo de 15 mililitros.
Enxágüe a parte inferior dos poços com 250 a 300 microlitres de DMEM F12 avançados no gelo, garantindo que não haja organoides no poço e se acumule no tubo de 15 mililitros contendo organoides colhidos. Resuspend a pelota organoide colhida de um a dois dias de idade em um mililitro de gelo frio avançado DMEM F12. Pré-reveste um tubo de 1,5 mililitro com PBS2 por células linfoides inatas replicam amostra e, em seguida, usando uma ponta PBS2 pré-revestida, distribuem aproximadamente 100 a 200 organoides no tubo.
Usando uma ponta P-1000 revestida de PBS2, adicione um volume de nada menos que 500 ILC1s calculado desde a etapa de classificação até o tubo de 1,5 mililitro revestido de PBS2 contendo os organoides. Gire ILC1 e organoides a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e certifique-se de evitar centrífugas de mesa de pequeno diâmetro, pois elas puxarão as células ao longo da borda do interior do tubo em vez de criar uma pelota na ponta do tubo. Em seguida, remova o sobrenante lentamente e suavemente sem perturbar a pelota e coloque a amostra no gelo.
Enquanto segura o tubo em uma superfície fria, resuspenja os organoides e o ILC em 30 microliters de matriz extracelular basal de cruzamento térmico pelo menos 10 a 15 vezes para garantir uma distribuição uniforme. Aplique 30 microliters por poço de organoides ILC na matriz extracelular basal de cruzamento térmico a uma placa pré-aquecida de 24 ou 48 poços para formar uma única cúpula. Depois, coloque a placa diretamente na incubadora por 10 a 20 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Em seguida, adicione 550 microliters de meio ILC1 completo por poço com qualquer citocina experimental desejada ou anticorpos de bloqueio e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após 24 horas, retire suavemente a placa da incubadora e deixe que a placa fique em uma capa de cultura de tecido por um minuto para garantir que os linfócitos sejam assentados. Remova de 200 a 250 microliters de mídia e coloque-o em um poço vazio de uma placa de 24 poços.
Usando um microscópio invertido, verifique o supernatante para garantir que nenhum linfócito foi removido. Se o supernatante estiver claro, adicione 300 microliters de meio ILC1 fresco à co-cultura no poço original. Se os linfócitos estiverem presentes no supernatário, centrífuga de 300 a 400 G por três a cinco minutos a quatro graus Celsius e resuspensar a pelota em 300 microliters de meio ILC1 fresco.
Em seguida, adicione a suspensão celular aos 200 a 250 microliters restantes de mídia no poço original. Realize a análise a jusante usando imunofluorescência, citometria de fluxo ou purificação FACS de populações-alvo em tampão de lise para análise de expressão genética por uma busca de RNA unicelular ou a granel ou RT-qPCR, conforme descrito no texto. Após a conclusão bem sucedida da passagem, culturas organoides saudáveis e robustas revelaram que as criptas recém-isoladas devem formar estruturas criptas brotantes dentro de dois a quatro dias.
A análise citométrica de fluxo foi realizada para isolar o pequeno ILC1 intestinal da linha de repórter transgênico de gamma-T ROR, e a faixa de contagem de ILC esperada foi encontrada em 350 a 3.500 células isoladas. Após serem semeadas com organoides, as coculturas podem ser visualizadas por citoquímica imunoquímica. A microscopia confocal revelou as imagens de pequenos organoides intestinais que são cultivados sozinhos e na presença de ILC1s.
A coloração imunocológica revela a presença de ILC1 CD45 positivo nas proximidades das células epiteliais procedentas de Zonula ocluintes em células epiteliais organoides ILC1. A citometria de fluxo demonstrou que a molécula de adesão celular epitelial marca células epiteliais intestinais em organoides, enquanto o CD45 marca ILC1s. A trama citométrica de fluxo e a imunoquímica revelaram aumento da expressão de CD44 em células epiteliais intestinais quando co-cultivado com ILC1.
Os estudos do RT-qPCR mostram que a co-cultura ILC1 especificamente aumentou a variante CD44 6, que foi inibida por TGF-beta 1, 2, 3 anticorpo neutralizante, e regulada por TGF-beta 1 recombinante em pequenas culturas intestinais-organóides. É importante ser gentil durante a manipulação dos organoides para garantir que todas as estruturas sejam mantidas e verificar se as estruturas foram pelotas suficientemente após a centrifugação. Ao aumentar a complexidade do sistema adicionando outros componentes imunes e não imunes, este sistema in vitro pode ser usado para abordar outras questões na biologia intestinal.
