Dissecção de ovário planário para análise ultraestrutural e coloração de anticorpos

O objetivo deste método é dissecar os ovários da planária Schmidtea mediterranea para análise celular e subcelular da biologia do oócito com coloração TEM ou anticorpo. Este protocolo usa uma breve etapa de fixação para facilitar a localização e dissecção dos ovários planários, o que fornecerá profundidade e qualidade de imagem que antes eram inacessíveis. A maior luta para alguém que nunca realizou essa técnica antes será localizar os ovários após a fixação.

Familiarizar-se com a anatomia das planárias sexuais antes do experimento será útil. Prepare-se para o experimento alimentando planárias sexuais com pasta de fígado orgânica duas vezes por semana para atingir a maturidade sexual. Trate vermes sexualmente maduros com 5% de N-acetil-L-cisteína, ou NAC, em um prato em temperatura ambiente por cinco minutos.

Substitua o NAC por 10 mililitros de paraformaldeído a 4% recém-preparado e fixe os vermes por uma hora em temperatura ambiente com agitação ocasional. Inicie a dissecção 10 minutos após adicionar 4% de paraformaldeído enquanto os vermes estão sendo corrigidos. Observe a pigmentação epitelial para localizar os cordões nervosos ventrais, que aparecem como duas linhas com pigmentação mais clara que vão dos gânglios cefálicos anteriores em direção à cauda.

Localize os ovários putativos observando a pigmentação e valide sua posição. Usando duas facas cirúrgicas, faça cortes posteriores e anteriores aos ovários para remover completamente os fragmentos de vermes anterior e posterior. Use uma faca para ancorar o verme e a outra faca para a dissecação.

Limpe a faca usada para fazer os cortes. Para separar os dois ovários, corte a linha do meio do fragmento do ovário e, em seguida, vire o fragmento com o lado ventral para baixo. Use dois pares de pinças pontiagudas tipo 5-SA para descascar o tecido dorsal e expor o intestino.

Remova suavemente os ramos intestinais que ficam acima dos tecidos ventrais com a ponta da pinça ou uma escova macia para expor o ovário. Remova os tecidos circundantes para retirar o ovário. Retire os ovários e transfira-os para um tubo de 1,5 mililitro para lavar com 1 mililitro de PBS.

Os padrões de pigmentação dorsal e ventral foram usados para localizar a posição dos ovários. O excesso de tecido foi aparado passo a passo. Uma vez que o ovário foi exposto, o tecido circundante foi aparado.

Ovários contendo vários tipos de células somáticas foram usados para análise ultraestrutural e coloração por imunofluorescência. Os ovários dissecados permitem imagens de alta qualidade da anatomia celular e subcelular dos oócitos. Este procedimento deve permitir que experimentos de interferência de RNA examinem as regulações moleculares da biologia do oócito.

Essa técnica levou à descoberta de um novo fenômeno nos oócitos de platelmintos em que o envelope nuclear se decompõe em vesículas encapsulando proteínas nucleares em vez de permanecer intacto, também conhecido como mitose fechada, ou quebrando em pedaços, também conhecido como mitose aberta.