Até o momento, CRISPR tem sido usado apenas em um punhado de Hemipterans. O protocolo descrito aqui poderia ajudar os pesquisadores a aplicar CRISPR e transformação germinativa em outras espécies de Hemiptera. Este protocolo foi desenvolvido especificamente para embriões de insetos sensíveis à dessecação.
Muitas etapas do protocolo poderiam potencialmente melhorar os resultados em outras espécies de insetos. A capacidade de gerar cigarrinhas transgênicas abre as portas para novos métodos de controle, como a criação de insetos que não podem mais transmitir vírus. Essa técnica será revolucionária para estudar a função gênica em outras pragas, como o tripes da flor ocidental.
Adaptamos esta técnica CRISPR para embriões tripes com resultados promissores. Achamos que a prática neste sistema é essencial para o sucesso. Os métodos mostrados aqui, quando realizados rotineiramente, devem permitir o uso flexível em uma variedade de configurações.
Para fazer uma câmara para segurar os insetos adultos Peregrinus maidis, corte um buraco no fundo de um copo de uma onça e cole uma tela sobre o buraco para troca de ar. Para a seleção de insetos fêmeas adultas de uma semana de idade, aspirar a colônia em um tubo cônico de 15 mililitros por uma hora, antes de resfriar brevemente os insetos no gelo. Identificar as fêmeas pela presença do ovipositor, que é tipicamente mais escuro do que o resto do abdômen, no lado ventral do abdômen.
Transfira as fêmeas para o copo à medida que são coletadas. Quando 15 fêmeas tiverem sido selecionadas, sele o copo com um pedaço de cinco por cinco centímetros de filme de cera de parafina. Aplique 400 microlitros de uma solução de sacarose a 10% na parte superior do filme e coloque um segundo pedaço de filme de cinco por cinco centímetros sobre a solução.
Coloque a câmara de adultos em uma placa de coleta de ovos com o lado da película plástica de parafina em contato direto com o meio de oviposição e envolva toda a câmara de postura de ovos com filme plástico sem cobrir os orifícios de ar. Em seguida, coloque a câmara a 25 graus Celsius com 70% de umidade e 14 horas de luz, ciclo escuro de 10 horas. Para a coleta de embriões, após o período desejado de oviposição, aplique uma tira de fita dupla face de um por 15 milímetros sobre uma lamínula de cobertura de 22 por 30 milímetros e coloque a tampa no meio de oviposição da câmara de postura.
Usando um pincel fino e um microscópio dissecante, mova embriões individuais semitransparentes da superfície do ágar para a fita dupla face. Quando cerca de 25 embriões tiverem sido selecionados, disponha os embriões em forma de banana em suas laterais com as extremidades maiores presas na fita. Para a microinjeção dos embriões, primeiro, coloque a tampa em uma placa de Petri de 100 por 15 mililitros com ágar 1% sob um microscópio dissecante dentro de uma coifa umidificada.
Para verificar a pressão de injeção, coloque a ponta de uma agulha de injeção de quartzo em uma gota de água e inicie o ciclo de injeção. Depois de confirmar o ajuste de pressão, aproximando-se do lado esquerdo da lamínula, insira a agulha na extremidade maior de um embrião. Entregue a solução injetável no ovo e retire rapidamente a agulha.
Quando todos os ovos tiverem sido injetados, coloque a tampa deslizar sobre a superfície de uma nova placa de ágar a 1% e coloque a placa em uma câmara de umidade. Após seis dias, use água limpa e escova fina para transferir os embriões sobreviventes para uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros contendo papel de filtro umedecido com água. Sele a placa de Petri com filme plástico de cera de parafina e coloque a câmara de eclosão em uma incubadora de 25 graus Celsius.
Após seis a oito dias, use uma escova fina para transferir qualquer ninfa emergente de primeiro ínstar para uma placa de Petri de recortes de folhas e sele a placa com filme plástico de cera de parafina. Após 48 horas a 25 graus Celsius, use uma escova fina para transferir todas as ninfas de dois dias para uma gaiola de criação com plantas de milho. Se os injetados com fenótipo visível forem recuperados em número suficiente, enjaule esses insetos separadamente para maximizar a recuperação da característica alvo na próxima geração.
Criar os insetos sob as condições adequadas de temperatura e umidade, com transferências regulares para plantas frescas de milho, conforme necessário, e selecionar regularmente a progênie para fenótipos esperados, colocando os indivíduos exibindo o fenótipo desejado em suas próprias gaiolas para estabelecer linhagens homozigotas. Nesta análise representativa, um total de 6.483 ovos foram coletados de um total de 645 fêmeas em quatro semanas. As fêmeas normalmente começam a colocar ovos após dois dias e fornecem a maioria dos ovos dos dias quatro a seis, com a atividade de oviposição diminuindo no nono dia.
A injeção de Cas9 nove não afeta o desenvolvimento de P.maidis, pois as taxas de desenvolvimento para embriões tratados com tampão de injeção, tampão de injeção suplementado com Cas9 e tampão de injeção suplementado com Cas9 e três RNAs-guia são semelhantes. As taxas de eclosão para os controles buffer e Cas9 também são semelhantes. No entanto, as taxas de eclosão dos indivíduos que recebem a mistura de três guias são tipicamente relativamente mais baixas.
Neste experimento representativo, dos 71 indivíduos injetados-guia que desenvolveram, 23 apresentaram algum grau de perda de pigmento e nove eclodiram, resultando em uma taxa de knockout de cerca de 30%A mistura de três guias deve remover aproximadamente 180 pares de bases do locus branco, como observado nos produtos de PCR amplificados a partir de DNA genômico isolado de indivíduos injetados, bem como nos dados de sequência associados gerados a partir desses produtos. Recomendamos o uso de agulhas chanfradas para minimizar o trauma de injeção. Se os embriões parecerem vazar após a injeção, examine as pontas da agulha para obter melhores resultados.
A prática continuada aumentará a sobrevivência do embrião. Até o momento, não há publicações descrevendo a transformação germinativa em Hemiptera. No entanto, temos usado este protocolo para fazer cigarrinhas que expressam Cas9.
Em geral, a capacidade de realizar a transformação germinativa em Hemipterans abre as portas para uma ampla gama de estratégias de manejo genético de pragas, reduzindo assim o uso de inseticidas.
