Caracterizar o modelo 3D in vitro em resolução celular e subcelular é crucial para a exploração completa, mas pode ser um desafio. Portanto, fornecemos protocolo complementar para a coloração e imagens de resolução subcelular de modelos fixos 3D in vitro que variam de 100 micrômetros a vários milímetros. As estruturas 3D são radiais e devem ser cuidadosamente manipuladas.
Antes de pipetar, verifique a localização de suas estruturas 3D dentro do tubo para evitar qualquer aspiração. Como adaptamos técnicas clássicas para a incorporação de pequenas estruturas, como organoides ou esferoides, as instruções visualizadas podem ajudar os usuários de primeira viagem a executar a tarefa com mais facilidade. Demonstrando o procedimento comigo estará Laura Francols, uma técnica de laboratório da Plataforma de Pesquisa em Patologia.
Para preparar amostras para coloração de montagem inteira 3D, use uma ponta de pipeta de um mililitro pré-codificada com BSA para adicionar uma suspensão de estrutura 3D de um mililitro a um tubo de 500 microlitros de PBS. Quando as estruturas 3D tiverem se acomodado no fundo do tubo, substitua cuidadosamente o PBS por 500 microlitros de solução de bloqueio de permeabilização por uma incubação de uma hora à temperatura ambiente com agitação horizontal suave a 30 a 50 rotações por minuto. No final da incubação, permita que as estruturas 3D sedimentem novamente antes de lavar cuidadosamente as estruturas 3D duas vezes em um mililitro de 0,1% PBS suplementado com BSA por três minutos por lavagem.
Após a última lavagem, rotule as estruturas 3D com 250 microlitros de anticorpo primário em PBS por dois a três dias com agitação horizontal suave a quatro graus Celsius. No final da incubação, lavar a amostra com cinco lavagens de três minutos e duas lavagens de 15 minutos em um mililitro de 0,1% PBS BSA por lavagem. Após a última lavagem, rotule as estruturas 3D com 250 microlitros do anticorpo secundário apropriado em PBS por 24 horas a quatro graus Celsius com agitação horizontal suave protegida da luz.
No dia seguinte, rotule as estruturas 3D com 250 microlitros da concentração adequada de Hoechst 3342 para uma incubação de duas horas a quatro graus Celsius com uma agitação horizontal suave. No final da incubação, lave as estruturas 3D cinco vezes por três minutos e duas vezes por 15 minutos em um mililitro de PBS por lavagem, conforme demonstrado. Após a última lavagem, transfira as estruturas 3D para uma microplaca de poliestireno preto de 96 poços e adicione suavemente 200 microlitros de solução de limpeza nas estruturas, evitando bolhas.
Em seguida, coloque a placa coberta com papel alumínio a quatro graus Celsius por pelo menos 48 horas. Para incorporar grandes modelos de cultura de células 3D, use uma ponta de pipeta de um mililitro revestida de BSA para transferir cuidadosamente as estruturas 3D para um tubo de vidro de fundo plano com uma tampa de garrafa revestida de PTFE. Após a assentação das estruturas, substitua cuidadosamente o PBS por etanol a 70% por uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente.
No final da incubação, substitua o etanol a 70% por um mililitro de solução de eosina Y pronta para uso. Mexa o tubo e manche as estruturas por pelo menos 30 minutos. No final da incubação, desidratar as estruturas com três lavagens sucessivas de 30 minutos em um mililitro de etanol a 100% por lavagem.
Após a última desidratação, limpe as estruturas 3D com três lavagens sucessivas de 30 minutos em um mililitro de xileno por lavagem sob um exaustor químico. Após a última imersão em xileno, coloque um pedaço de almofada de biópsia embebida em xileno em um compartimento de um de tecido microgêmeo branco e use uma pipeta Pasteur de plástico de dois mililitros revestida de BSA para transferir as estruturas 3D para a almofada. Cubra as estruturas 3D com outra almofada de biópsia embebida em xileno para manter as estruturas 3D no lugar e fechar o.
Quando todas as amostras tiverem sido transferidas, coloque as em um banho de parafina de 65 graus Celsius por 30 minutos antes de colocar as em um banho fresco de parafina de 65 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, adicione parafina líquida a um molde de incorporação aquecido a 65 graus Celsius por amostra e coloque uma amostra embutida em parafina em cada molde. Agite suavemente os moldes até que todas as estruturas 3D caiam para o fundo e use pinças finas aquecidas a 65 graus Celsius para posicionar as estruturas 3D no centro de cada molde.
Resfrie o molde até que a parafina forme uma fina camada sólida, prendendo a estrutura 3D no lugar. Coloque um de tecido e adicione parafina quente sobre o molde. Remova o molde quando a parafina tiver se solidificado completamente.
Para incorporar pequenos modelos de cultura de células 3D, lave suavemente as estruturas 3D três vezes em um mililitro de TBS por lavagem. Após a última lavagem, remova o máximo de TBS possível sem tocar nas estruturas e adicione duas gotas de reagente duas de um kit comercial de incorporação de parafina. Misture suavemente batendo e adicione duas gotas de reagente uma com batida até que o gel se solidifique.
Use pinças finas para transferir o gel do poço do pré-montado do kit e desidrate a amostra embutida em gel com incubações ascendentes de etanol e xileno ascendentes de 30 minutos em um exaustor, conforme indicado. Após a última imersão em xileno, coloque o em um banho de parafina de 65 graus Celsius durante a noite antes de usar pinça fina para transferir a amostra embutida de parafina para o centro de um molde de incorporação aquecido de parafina líquida carregada a 65 graus Celsius. Em seguida, proteja a estrutura 3D com mais uma camada de parafina, conforme demonstrado para os grandes modelos de cultura de células 3D.
A coloração tridimensional de montagem inteira e a microscopia confocal fornecem informações visuais sobre a composição celular e a posição espacial dos modelos de cultura 3D para um campo de profundidade de até 200 mícrons. A alta resolução que pode ser obtida para estruturas 3D usando este protocolo permite a aplicação de algoritmos de segmentação celular e subcelular para quantificação do número de células e a detecção de vários marcadores celulares dentro de diferentes subtipos celulares. A análise de montagens inteiras 3D pode ser aplicada a células visualizadas de até 200 mícrons de profundidade, independentemente de todas as estruturas.
Pelo contrário, a análise de seção 2D pode fornecer insights sobre células de qualquer tamanho.
