Síndrome de Turner é uma condição rara associada a um cromossomo X completamente ou parcialmente ausente. A síndrome é caracterizada por infertilidade, baixa estatura, doenças cardiovasculares e defeitos neurocognitivos. Em alguns casos, causa morte fetal.
Embora as células somáticas dos fetos aneuploides sejam biologicamente valiosas, elas são de curta duração, limitando assim seu uso em pesquisas. A geração de iPSC é, portanto, um método eficaz de preparação celular para a conservação perpétua dos traços aneuploides. Eles são auto-renovados e podem se diferenciar em tipos de células especializadas que lembram o desenvolvimento embrionário precoce.
A entrega de plasmídeos de reprogramação episômica não integrados através da ficção nuclear é um método eficiente e reprodutível para gerar iPSCs completamente reprogramados e estáveis. Este método também pode ser usado em células de difícil programa. Neste protocolo descrevemos a regeneração de iPSCs a partir de material fetal com aneupliod.
Transfira o villi coriônico fetal coletado para uma placa de Petri estéril. Lave-o várias vezes com PBS contendo solução antimicomótica antibiótico 1X. Remova o PBS completamente por pipetação.
Adicione 1 ml de mistura de colagenase ao villi e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos ou até que o tecido se desintegre. Após a incubação, neutralize a colagem adicionando mídia contendo soro bovino 10% fetal. Transfira o conteúdo da placa de Petri em um tubo de 15 ml.
Centrifugar o digestor para coletar o villi desintegrado e células liberadas. Decante o supernatante com cuidado. Placa desintegrou villi junto com células liberadas em um frasco de cultura T25 e mídia AmnioMAX e crescer até que uma cultura fibroblasto confluente é obtida.
Expandir os fibroblastos e a cultura para preparar estoques para uso em experimentos subsequentes de transfecção e caracterização. Prepare culturas de alcalino contendo os plasmídeos reprogramantes. Isole os plasmídeos usando o kit de purificação de plasmídeos Midi, de acordo com as instruções do fabricante.
Suspenda-se cada palete em volume adequado de água livre DNAse RNAse para obter uma concentração final de 1 micrograma por mililitro. Verifique os plasmídeos usando o kit de digestão de restrição ECoR1, seguindo as instruções do fabricante. Trypsinize os fibroblastos de villi coriônicos.
Neutralizar e centrífuga para coletar as células. Decante o supernasce, e suspenda as células em 5 ml OPTI-MEM. Conte as células usando um hemótmetro, e remova 1 milhão de células para nucleofeiciação.
Centrífuga para obter palete celular. Realize a nucleofecção usando o Kit Neucleófico Amaxa NHDF. Prepare o reagente neucleófato misturando suplemento de 0,5 mL e solução nucleófato de 2,25 mL fornecida no kit.
Remova 100 microliters de solução nucleofato e adicione 1 micrograma de cada plasmídeo a ele. Levemente suspender 1 milhão de células nesta mistura. Transfira a suspensão do DNA celular para cuvette, garantindo que a amostra cubra a parte inferior do cuvette sem bolhas de ar.
Tampe a cuvette e insira no suporte. Selecione o programa nucleofato D-23 para alta eficiência e aplique. Retire o cuvette do suporte e adicione 1 mL de mídia AmnioMAX.
Transfira o conteúdo suavemente para uma placa de Petri tratada com cultura tecidual, utilizando a pipeta fornecida no kit. Incubar as células em uma incubadora de dióxido de carbono umidificada a 37 graus Celsius. Mantenha as células em mídia AmnioMAX por 10 dias e, em seguida, mude para o meio de pluripotência por 20 dias.
Para a expansão do iPSC, disseque manualmente as colônias embrionárias semelhantes a células-tronco formadas no prato de reprogramação usando uma pipeta de vidro puxada. Propigue iPSCs adequadamente, e massageie a cada cinco ou sete dias. Os IPCA foram positivos para a fosfatase alcalina marcador de pluripotência.
Gerar corpos embrionários cortando as colônias iPSC em pequenos pedaços e emplacando-as em placas de Petri de baixa fixação em meio corporal embrionário. A diferenciação do ectoderm é induzida pelo dia do emplacamento quatro corpos embrionários no meio de diferenciação de ectoderm. Da mesma forma, a diferenciação do mesoderm é induzida pelo dia de chapeamento de oito corpos embrionários no meio de diferenciação de mesoderm.
Para induzir a diferenciação de endoderm, a cultura iPSCs em uma monocamadas em meio de diferenciação de endoderm. Alterações morfológicas nos fibroblastos foram monitoradas ao longo da reprogramação. Eles expressam morfologia epitelial semelhante a células e formaram colônias compactas.
As células também tinham um núcleo de altura para a razão citoplasmática, típica de células pluripotentes na cultura. Os iPSCs possuíam um tipo de porta-aviões 45 XO e foram positivos para marcadores de pluripotência OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 e E-CADHERIN. As células foram manchadas por marcadores representativos de camada de germes.
A Síndrome de Turner desenvolve assim déficits neurocognitivos. Neurônios derivados da Síndrome de Turner iPSC podem ser um excelente modelo. Isto é modelado em uma placa de petri para entender a nova linha da síndrome de Turner desassociativa normal.
