A análise da microscopia eletrônica é frequentemente complexa. Acreditamos que nosso protocolo facilita o processamento e aquisição dos dados EM a partir da grande superfície da amostra e volume intermediário. Nosso protocolo ajuda a encontrar estruturas alvo em seções seriais.
O registro de dados é limitado ao que é necessário. Em comparação com a aquisição de dados em blocos de tecido inteiro, o tempo de gravação é reduzido e a análise de dados é mais fácil. Dada a facilidade geral da abordagem, acreditamos que ela pode ser usada para abordar não apenas questões científicas, mas também como uma ferramenta de diagnóstico.
Para gerar uma matriz para análise, primeiro aperte a amostra em um suporte ultramicromédo e use uma lâmina de barbear para aproximadamente aparar a resina ao redor da amostra. Use uma ferramenta de corte de diamante para aparar bem a amostra e use facas de corte de inclinação de 20 ou 90 graus para garantir que as superfícies superior e inferior do bloco estejam paralelas à borda de corte da faca. Misture o xileno e a cola em uma proporção de 3:1 e use um cílio preso a um palito para aplicar a mistura nas bordas superior e inferior do bloco aparado.
Enquanto a mistura estiver secando, use uma ferramenta de corte de wafer para cortar um pedaço de wafer ao tamanho apropriado para a análise. Limpe o wafer em água destilada para enxaguar os detritos e limpar a superfície com plasma depois que o wafer estiver seco. Para preparar uma faca de tomografia, use fita adesiva espumosa para prender uma agulha na parte inferior de uma faca histo jumbo e coloque a faca no suporte de ultra microtómeo a zero graus.
Ajuste a borda da faca paralela à superfície do bloco e leve o bloco aparado para a borda da faca em uma posição pronta para secção. Coloque o wafer limpo na bacia da faca e encha a bacia com água ao mesmo nível da borda da faca, em seguida, deixe a borda de diamante da faca umidificar corretamente, usando a seringa presa para adicionar ou retirar a água conforme necessário. Para seção de matriz, defina o microtome para uma faixa de corte de 50 a 100 nanômetros e uma velocidade de corte de 6 a 1 milímetros por segundo, e comece a seção para obter uma fita longa o suficiente para cobrir um volume Z direcionado.
Dependendo do tamanho do bloco, homogeneidade do tecido e tipo de resina, a fita será aproximadamente reta. Use uma ponta limpa e anti pegajosa de um cílio para separar as fitas da borda da faca. Use o cílio para mover suavemente a fita para o centro do meio de suporte.
Clorofórmio ou caneta de aquecimento podem ser usados para esticar a seção, se necessário. Após o alongamento, retraia a seringa para começar a drenar a água. Para fitas mais delicadas, ou uma retração de água mais lenta, retire a seringa da mangueira para deixar a água escorrer.
Quando o nível da água atingir o nível do wafer, empurre suavemente a fita para o centro da bacia e continue a drenar até que toda a água restante seja completamente removida da bacia. Deixe o wafer secar em um ambiente limpo. A secagem leva aproximadamente 30 minutos.
Quando a amostra estiver completamente seca, transfira a matriz para uma caixa bem fechada para protegê-la da contaminação da sujeira. E coloque a caixa em um forno de 60 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Para adquirir um mapa de visão geral das imagens SEM que revelam os locais da seção no wafer, use a câmera óptica incorporada para adquirir uma imagem SEM que cubra uma fita de seções.
Para criar um mosaico, clique e arraste a imagem da câmera da amostra e inicie a aquisição automática. Adquira visões gerais em maior resolução para encontrar estruturas-alvo. Se apenas algumas seções precisarem ser imagens, use o visualizador zoom para visualizar imagens adquiridas em seus locais originais.
Uma vez identificada uma seção que deve ser imagem em alta resolução, clique e arraste para criar uma região de imagem, selecione Configurações de imagem de alta resolução e armazene as configurações em um modelo Para encontrar eventos raros particularmente pequenos ou difíceis de detectar, use as configurações de imagem de alta resolução em cada seção 10 ou em uma seção por fita para criar manualmente uma região de imagem e adquirir as imagens. Em seguida, revise as imagens e marque seções que contenham a região de interesse. Para adquirir mais de 10 seções consecutivas, use o localizador de seção para localizar todas as seções automaticamente.
Se as imagens de visão geral não mostrarem regiões claras de interesse, adquira imagens de maior resolução das seções e use a função de visualização da seção para criar e adquirir as imagens automaticamente. Para determinar as configurações de imagem ideais, ative a imagem ao vivo no software de controle de microscópio e navegue até uma região de interesse, em seguida, ajuste as configurações de imagem até que as imagens mostrem regiões claras de interesse, mas sem uma aquisição excessiva de imagens, de acordo com as diretrizes do fabricante. Para otimizar o posicionamento das regiões de imagem em seções consecutivas, amplie a imagem de interesse e clique em Iniciar o Refinamento de Posição para aumentar a precisão dos locais de seção registrados.
Para definir uma região de imagem, clique e arraste em qualquer seção enquanto segura a tecla Alt e selecione Criar conjunto de azulejos no menu de contexto pop-up. O software criará regiões de imagem no mesmo local relativo em todas as seções que foram encontradas ou marcadas anteriormente. Em seguida, configure a contagem de pixels, o tamanho do pixel, o layout de revestimento e o tempo de moradia dos pixels em cada série de imagens, conforme necessário.
Para configurar a função automática, crie uma série de imagens separada para funções automáticas como demonstrado e mova a série de imagens para uma posição na seção que contém estruturas de alto contraste. Defina a série de imagens para 1024 x 884 pixels e selecione um tamanho de pixel correspondente à maior resolução usada na série de imagens. Na lista de funções automáticas, verifique o foco automático e o estigma automático.
Selecione Bisection nos controles de sequência de aquisição e confirme que a imagem da função automática é o primeiro item da lista e clique em Adquirir Tudo para iniciar a aquisição da imagem. Quando todas as séries de imagens tiverem sido criadas e configuradas, a série será listada em uma fila de empregos. A aquisição de baixa resolução pode ser realizada manualmente ou automaticamente diretamente em partes selecionadas da seção ou em uma seção inteira usando imagens únicas ou de mosaico, seguidas de costura.
Imagens da área selecionada podem então ser adquiridas usando parâmetros de alta resolução para visualizar mitocôndrias, núcleos e microvilli, por exemplo, Após a aquisição automática de mapas de mosaico resolvidos, várias regiões de interesse podem ser cortadas ou usadas para definir áreas de imagem locais adicionais dentro das regiões. Embora diferentes tipos de células especializadas no intestino Drosophila sejam distribuídos aleatoriamente, eles podem ser visualizados após a triagem das imagens usando parâmetros de alta resolução, seja de seções únicas ou como uma coleção de imagens seriais. Após o alinhamento, as pilhas podem ser renderizadas usando diferentes soluções de software.
A análise da tomografia do array permite que muitas seções sequenciais sejam geradas no wafer único e sejam examinadas usando parâmetros de baixa resolução para localização das áreas gerais de interesse. Essas áreas podem ser direcionadas para análise suplementar usando parâmetros avançados de aquisição. Por exemplo, divisões mitóticas no notum não são fáceis de localização no nível ultraestrusivo, pois as células são relativamente grandes em comparação com a zona de abscisão.
Usando este método, no entanto, as imagens de visão geral automática de resolução média dos saltos de 20 a 40 seções podem ser usadas para localização das células divisórias. O procedimento de tomografia do array fornece uma análise mais simples de dados de microscopia eletrônica. Incentivamos os espectadores a investir em dominar a regeneração e se familiarizar com o fluxo de trabalho relacionado aos mapas Em nossa experiência, poucos tópicos de pesquisa exigem a análise ultraestrutural de animais inteiros ou órgãos inteiros.
Nosso método ajuda na rápida localização das células e seus parceiros de interação nos tecidos.
