Este protocolo usa lagostas americanas juvenis como modelo para demonstrar o uso da pneumografia de impedância para avaliar o desempenho fisiológico durante um estresse térmico. Esta técnica passa uma pequena corrente elétrica oscilante através de dois eletrodos implantados em ambos os lados do coração e mede a mudança de tensão à medida que o músculo contrai e relaxa. Esta tensão pode então ser facilmente convertida em batidas por minuto para traçar a frequência cardíaca através da faixa de temperatura avaliada para determinar janelas de desempenho térmico.
Esta técnica é minimamente invasiva e permite a coleta de dados em tempo real em organismos em estágio final em que pode ser difícil observar diretamente o desempenho cardíaco. Este método também se concentra no cálculo da temperatura de quebra de Arrhenius ou ABT e usa-o como um ponto final não letal para determinar limites térmicos. Enrole tubos maleáveis claros em torno de si mesmo para criar uma bobina de troca de calor que tem aproximadamente oito a 10 centímetros de diâmetro e tem extensões de 40 a 70 centímetros de comprimento.
Fixar a bobina usando fita elétrica. Fixar a bobina de troca de calor à fonte externa e devolver os encaixes do banho de água circulante. Certifique-se de que a conexão está segura usando grampos de mangueira.
Encha o poço do banho de água circulante com água de osmose reversa e conecte o cabo de alimentação em uma tomada. Ligue o banho de água e certifique-se de que não há vazamentos em sua conexão com a bobina de troca de calor. Configure o conversor de impedância conectando o cabo BNC preto à saída CA na unidade e conectando-o ao jato de dados do laboratório de energia usando a porta do canal um.
Conecte o ormistor ao pod tipo T e, em seguida, conecte o pod tipo T no canal dois porta do data logger do laboratório de energia. Conecte o cabo de alimentação do suporte de dados do laboratório de energia em uma fonte de alimentação e conecte o data logger a um computador de PC usando o conector do cabo USB. Encha a câmara de aclimatação na arena experimental com 7,5 litros de água do mar artificial.
Coloque a lagosta em uma grade de plástico. Segure cuidadosamente as garras das lagostas e o abdômen na rede de plástico usando pequenas amarras de cabo. Seque a carapaça com uma toalha de papel e limpe-a com um cotonete encharcado em 70% de etanol.
Faça cuidadosamente dois pequenos furos quase através da carapaça em ambos os lados do pericárdio. Finalize cada orifício inserindo suavemente uma agulha dissecando estéril. Raspe um pouco do isolamento dos fios usando uma lâmina de barbear.
Dobre cuidadosamente a ponta de cada fio usando fórceps e insira um em cada um dos orifícios recém-perfurados. Fixar cada cabo usando uma pequena gota de supercola e deixe secar por cinco a 10 minutos. Uma vez que a cola esteja seca, conecte o fio leva ao conversor de impedância e ligue-o.
Coloque a lagosta na câmara de aclimatação e deixe aclimatar os eletrodos implantados por 15 a 20 minutos. Ligue o laboratório de energia e abra o software do gráfico de laboratório no computador. Clique em Novo experimento e deixe a tela de exibição do gráfico aberta.
Na visualização do gráfico, localize o menu de função do canal para o Canal Um. Escolha amplificador de entrada no menu e selecione acoplamento CA. No conversor de impedância, ajuste o ganho e o equilíbrio até que um sinal forte seja observado na saída do laboratório de potência, visando manter o equilíbrio perto de zero.
No canal dois selecione pod tipo T para gravar dados de temperatura em tempo real. Clique no botão Iniciar e o laboratório de energia começará a registrar dados. Coloque a grade de plástico com a lagosta presa cuidadosamente na arena experimental e coloque a bobina de troca de calor no topo da grade.
Coloque o estermícula perto da lagosta, antes de colocar a tampa na arena experimental para reduzir o estresse visual na cobaia. Ajuste o saldo conforme necessário e coloque um comentário sobre a saída afirmando que o julgamento já começou. A saída deve ser salva periodicamente durante todo o experimento.
Clique em Arquivar e selecione Salvar Como salvar inicialmente a saída para o computador. Aumente a temperatura da água da arena experimental a uma taxa de aproximadamente 1,5 graus Celsius a cada 15 minutos para alcançar uma rampa de 12 a 30 graus Celsius durante um período de duas horas e 30 minutos, ajustando a temperatura do banho de água recirculando. Quando a rampa estiver concluída, retire a lagosta da arena experimental e coloque-a em um banho de recuperação por aproximadamente 20 minutos.
Após 20 minutos, aperte o botão stop na saída do laboratório de energia e salve o arquivo. Remova cuidadosamente os eletrodos e corte os cabos antes de devolver o objeto de teste ao seu tanque de retenção. Abra a plataforma de dados clicando no menu Janela e selecionando o data pad.
Defina a coluna A para ser tempo clicando duas vezes na coluna A e clicando em seleção e Ponto Ativo, selecione o tempo e feche a janela clicando em OK. Defina a coluna B como a temperatura média sobre a porção selecionada de dados clicando duas vezes na coluna B e selecionando Estatísticas. Selecione a média do lado direito do menu e o canal dois como a fonte de cálculo na parte inferior da janela do menu. Clique duas vezes na coluna C e selecione seleção e Ponto Ativo.
Selecione a duração da seleção, clique em OK para fechar a janela. Clique duas vezes na coluna D e selecione medidas cíclicas. Selecione a contagem de eventos, selecione o canal um como a fonte de cálculo, clique em OK para fechar a janela.
Isso contará os picos dos dados para determinar a frequência cardíaca em uma porção selecionada de dados. Clique duas vezes na coluna E e selecione medidas cíclicas. Selecione a taxa cíclica média e o canal um como a fonte de cálculo na parte inferior da janela menus.
Clique em OK para fechar a janela e isso fornece a estimativa final da frequência cardíaca como batidas por minuto sobre uma porção selecionada de dados. Volte para o arquivo de dados e destaque as seções desejadas da saída. Selecione comandos e vários adicionamentos ao data pad.
Selecione o tempo e puxe os dados a cada 30 segundos, verificando cada caixa e inserindo 30 no menu Selecionar. Clique na seleção atual e clique em Adicionar. Retorne à tela do data pad e selecione Arquivo e Salvar Como salvar a saída como um arquivo Excel.
Abra o arquivo de dados no Excel. Converta a temperatura dos graus Celsius para o inverso de Kelvin. Pegue o registro natural da frequência cardíaca, gere um enredo de Arrhenius plotando a frequência cardíaca em função da temperatura.
Encaixe esses dados com uma regressão fragmentado e determine o ponto de intersecção. Esta é a temperatura do freio Arrhenius ou ABT. Este é um exemplo de saída esperada usando o data logger do laboratório de energia.
A tensão é mostrada em vermelho e a temperatura da arena em azul. Esses dados mostram uma distribuição esperada da frequência cardíaca ao longo de uma rampa de temperatura. Finalmente, este painel mostra uma esperada trama de Arrhenius de um animal experimental.
Encaixada com uma regressão fragmentante, a estrela vermelha destaca sua intersecção que é a temperatura de quebra de Arrhenius. Ao usar esta técnica, é importante permitir que seu objeto de teste tenha períodos adequados de aclamação e tempo de recuperação para garantir que você esteja registrando com precisão o desempenho cardíaco. Também é importante determinar a taxa apropriada de aquecimento para o seu experimento antes de executá-lo em um cobaia de teste.
Embora nos concentremos apenas na temperatura neste vídeo, essa técnica pode ser amplamente aplicada para entender os impactos ambientais na fisiologia do organismo, pré-expondo sujeitos de teste a estressores adicionais, como acidificação do oceano, ou redução da disponibilidade de oxigênio antes de executá-los através da rampa de temperatura.
