Esta técnica facilita a observação em tempo real da atividade sináptica de cálcio como parâmetro fisiológico para os processos celulares subjacentes à aprendizagem e formação da memória em drosophila melanogaster. Comparando respostas neuronais com odores antes e depois do treinamento associativo, podemos desenhar correlações diretas entre a atividade sináptica e a formação do traço de memória em moscas de frutas individuais. Para produzir moscas de frutas transgênicas em que neurônios específicos de interesse expressam um indicador de cálcio geneticamente codificado cruzam moscas fêmeas e machos carregando as construções GAL4 e UAS desejadas, e envelhecem a progêneria feminina até três a seis dias após a eclosão.
Para preparar uma mosca para a imagem, use fórceps finos para colocar uma mosca anesthetizada de gelo em uma câmara de imagem personalizada. Usando um microscópio dissecando para posicionar o tórax e as pernas em contato com os fios elétricos na parte inferior da câmara, e com a cabeça deitada plana. Fixar a mosca no lugar com fita adesiva clara, e use uma lâmina de bisturi cirúrgica para cortar uma janela na fita ao redor da cabeça, deixando a antena coberta e apenas a parte anterior da parte mais do tórax exposta.
Use um pino de inseto segurado por mandíbulas côncavas-convexas para cercar cuidadosamente os lados e a parte de trás da cabeça com cola de cura de luz azul. E use uma lâmpada LED emissora de luz azul para definir a cola. Quando a cola estiver completamente definida, limpe qualquer cola residual não hardened da superfície dorsal da cabeça de mosca e cubra a cutícula exposta da cabeça com uma gota da solução de Ringer.
Usando uma faca de faca de lâmina muito fina, corte a cutícula através da parte posterior da cabeça, começando no ocelli e cortando cada lado medial para os olhos para formar um retalho da cutícula que pode ser facilmente arrancado usando fórceps. Remova qualquer cutícula em excesso que possa bloquear a região do cérebro de interesse e use fórceps finos para limpar cuidadosamente a superfície dorsal de qualquer traqueia, tomando cuidado para evitar a ruptura do próprio tecido cerebral. Remova e atualize a solução do Ringer conforme necessário para limpar a área dos detritos teciduais.
E coloque uma agulha de entrega de odor hipodérmico a aproximadamente um centímetro da cabeça da mosca, tomando cuidado não há nada que possa obstruir a entrega de odor na antena. Em seguida, conecte a câmara de imagem ao sistema de distribuição de odor através da agulha de entrega de odor hipodérmico. E deixe a mosca 10 minutos para se recuperar da anestesia e da cirurgia.
Para visualização dos indicadores de cálcio baseados em GFP, sintonize o laser de um microscópio multifóton equipado com um laser infravermelho e um objetivo de imersão de água instalado em uma mesa isolada de vibração a um comprimento de onda de 920 nanômetros e instale um filtro de bandpass GFP. Usando o botão de ajuste Z do curso, escaneie através do eixo Z do cérebro para localizar a região cerebral de interesse. Use a função crop para focar a digitalização apenas na área de interesse, para minimizar o tempo de varredura.
E gire a visão de varredura de tal forma que o anterior da cabeça está voltado para baixo. Em seguida, ajuste o tamanho do quadro para 512 por 512 pixels e selecione a região a ser digitalizada. Levando em conta o tempo de varredura calculado para cada quadro, para alcançar uma taxa de quadro de pelo menos quatro hertz.
Para visualização transitória de cálcio evocada pelo odor, inicie um pacote macro pré-programado capaz de vincular o software de aquisição de imagens e o programa de entrega de odor e inicie a medição no software de microscópio por 6,25 segundos para estabelecer um valor de linha de base F0. No sistema de entrega de odor, entregue um estímulo de odor de 2,5 segundos indicado aqui pela iluminação dos LED's acionados pela abertura e fechamento de válvulas específicas de copo de odor. Seguido por 12,5 segundos de gravação no final do deslocamento do odor.
Em seguida, repita a entrega para um segundo e terceiro odor da mesma maneira. Para realizar o condicionamento associativo nesta configuração, use o sistema de entrega de odor controlado pelo computador para apresentar o estímulo condicionado-mais-odor por 60 segundos ao lado de 12 choques elétricos de 90 volts. Após uma pausa de 60 segundos, apresentam o estímulo condicionado-menos-odor sozinho por 60 segundos sem choque elétrico.
Meça o odor pós-treino evocando a transitoriedade do cálcio novamente, repetindo o protocolo de estimulação do odor pré-treino três minutos após o término da fase de treinamento. Em seguida, salve os arquivos de imagem em um formato apropriado para análise posterior de imagem. Aqui imagens representativas do neurônio de saída do corpo do cogumelo, adquiridas como demonstrado podem ser observadas.
A expressão compartimentalizada específica do sensor dHomer-GCaMP3, que não é expressa nos compartimentos axonais do neurônio, demonstra um sinal pontuado no compartimento dendrrítico. Respostas claras, embora de menor amplitude, podem ser observadas em moscas expressando dHomer-GCaMp3, em comparação com moscas expressando GCaMP6f citosoúnica. Aqui, traços representativos de cálcio de uma mosca individual demonstram variâncias no nível de ruído e amplitude que podem ser obtidas entre as preparações individuais.
Esta técnica abriu a possibilidade de visualização no nível subcelular, como as representações olfativas são moduladas e como as fases da memória são formadas através do condicionamento. Tais experimentos serão vitais para expandir nossa compreensão de estruturas cerebrais complexas, como o corpo de cogumelos, e para caracterizar como memórias associativas são armazenadas em populações distribuídas de neurônios.
