Entidades vinculantes de SUMÔ possibilitam isolar proteínas endógenas sumoylated in vivo. Isso é bastante desafiador devido à presença de protease específica de SUMS ativo e às baixas frações de proteínas sumoylated in vivo. O isolamento do proteome SUMOylated usando entidades vinculantes ao SUMH é vantajoso, pois adia um aumento na afinidade geral por substratos de SUM.
Isso se deve ao fato de que os SUBEs são comuns em proteínas que compreendem repetições tandem de SIMs, reconhecendo especificamente moléculas de SUMÔ em proteínas modificadas. O uso de entidades vinculantes ao SUMS para o isolamento e caracterização do proteome SUMOylated no câncer de fígado é um método rápido e sensível. Fornece informações passadas sobre o papel bastante desconhecido da via sumoylation no câncer de fígado em uma abordagem terapêutica potencial.
Entidades de ligação de SUMÔ podem ser utilizadas para isolar e caracterizar o proteome SUMOylated em outros tecidos além do fígado, tanto de espécimes humanos quanto de modelos animais, bem como em diversos modelos celulares. Embora essa técnica seja fácil de executar, deve-se tomar cuidado ao analisar várias amostras do mesmo tipo. cubo mais frio para os vários passos envolvidos.
Por isso, recomendamos um nivelamento cuidadoso dos tubos antes de iniciar este experimento. A demonstração visual do uso de entidades vinculantes ao SUMO facilita a revolução deste protocolo especialmente devido às dificuldades de manuseio dos bits e à perda de material durante o protocolo. As células hepatoma humanas foram previamente preparadas por células de revestimento em placas P100 a uma densidade de 1,2 a 1,5 milhões de células por prato e as mantêm em meios de crescimento padrão a 37 graus Celsius.
Quando estiver pronto para usar as células, aspire a mídia das placas e lave-as com cinco milímetros de PBS estéril. Coloque a placa no gelo e adicione 500 microliters de tampão de lise suplementados de acordo com as instruções do manuscrito. Em seguida, use um raspador de células para raspar suavemente as células da parte inferior da placa no meio da lise.
Alternativamente, colde as células por trippsinização e adicione um mililitro de trypsin-EDTA à placa certificando-se de que as células estão cobertas. Coloque a placa em uma incubadora Celsius de 37 graus por cinco minutos para permitir que elas se desprendem da placa, em seguida, adicione dois mililitros de meio de crescimento pré-aquecido para parar a trippsinização. Centrifugar as células a 150 vezes G por 10 minutos e aspirar o supernante.
Em seguida, lave as células com PBS e centrífuga por mais 10 minutos. Aspire o supernascer e adicione 500 microliters de tampão de lise. Centrifugar as células de lise a 15.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos, depois transfira os sobrenantes para um tubo fresco e descarte a pelota.
Quando estiver pronto para usar os fígados de camundongos colhidos, homogeneize 75 miligramas de fragmentos congelados frescos ou quebrados em um mililitro de tampão de lise gelada. Execute o homogeneizador de acordo com as instruções do manuscrito. Após a homogeneização do tecido, centrifugar as amostras a 15.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.
Transfira o supernatante para um tubo fresco e descarte a pelota. Prepare as contas de glutationa adicionando um mililitro de água desionizada a 70 miligramas de contas e reconstituindo-as durante a noite em quatro degress Celsius. Após o inchaço, lave as contas três vezes com 10 mililitros de água desionizada ou PBS, centrifugando a 300 vezes G por cinco minutos após cada lavagem.
Após as lavagens, resuspenque as contas em um mililitro de PBS para obter um chorume de 50% para cada amostra a 100 microgramas de GST-SUBEs ou controle GST a 100 microliters do chorume de glutationa e 500 microliters de PBS. Incubar a mistura a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas durante a rotação, em seguida, recuperar as contas por centrifugação a 300 vezes G por cinco minutos e resuspensá-las em PBS. Pegue 10% do liseto celular previamente preparado e dilua-o em um volume igual de tampão de ebulição 3X.
Adicione 450 microliters do lysate esclarecido a 100 microliters do chorume de glutationa. Incubar o lise com as contas a quatro graus Celsius por pelo menos duas horas enquanto gira lentamente. Após a incubação, gire as contas a 300 vezes G por cinco minutos e colete o supernasal para análise.
Transfira 10% do volume total para um tubo separado e adicione um volume igual de tampão de ebulição 3X. Lave a amostra restante três vezes adicionando um mililitro de PBS gelado com 05% Tween 20 e girando-a a 300 vezes G e quatro graus Celsius por um minuto. Aspire cuidadosamente o supernascida certificando-se de que nenhum líquido permanece.
Em seguida, elute a amostra com 15 microliters de tampão de ebulição 3X e 15 microliters de tampão de lise. Execute uma análise de manchas ocidentais de acordo com as instruções do manuscrito. Se realizar a Mass-Spectrometria, desalte os peptídeos usando microcolumns C18 de ponta de palco e resuspenque-os em ácido fórmico de 0,1% antes da análise.
Carregue as amostras em um sistema LC-MS e analise-as em triplicado. Proceda com identificação de proteínas e cálculo de abundância usando o software associado. Realizar análise estatística de acordo com as instruções do manuscrito.
Este protocolo tem sido usado para isolar proteínas SUMOylated em camundongos com deficiência de glicina N-metiltransferase que causa o desenvolvimento espontâneo do câncer de fígado e seus companheiros de ninhada do tipo selvagem. A coloração ponceau S foi realizada nas frações de entrada, fluxo e BOUND do ensaio de retirada de SUBEs. A análise de manchas ocidentais do LKB1 capturado com SUBEs mostra que os níveis de SUMOylation LKB1 são aumentados em tumores hepáticos.
Células hepatoma humanas e células epiteliais hepáticas não transformadas foram usadas para investigar a capacidade da armadilha SUMO de interagir com proteínas naturalmente sumoylated. Primeiro, a coloração de proteínas convencionais foi utilizada para visualizar o material total capturado com SUBEs. Em seguida, a Mass-Spectrometria mostrou que 742 proteínas foram enriquecidas na amostra de SUBEs da célula hepatoma e 577 foram enriquecidas na amostra de SUBES de células não transformadas do epitelial hepático.
Ao realizar experimentos com SUBEs, é importante manter células e tecidos no gelo e adicionar mililitros específicos ao tampão de lise, a fim de manter a pureza do SUMOylated. Após a visualização do proteome SUMOylated com SUBEs, podemos encontrar a caracterização usando análise de manchas ocidentais ou mass-Spectrometria. A aplicação dos SUBEs para isolar e caracterizar o proteome SUMOylated em tecidos de câncer de fígado e células hepatoma está abrindo caminho para explorar o papel das modificações pós-translacionais do SUMO no câncer de fígado que podem fornecer um mecanismo terapêutico potencial.
