Este método permitirá aos pesquisadores quantificar a dinâmica inicial da adesão celular e a disseminação de células dependentes de ancoragem na fibronectina de proteínas da matriz extracelular durante o estresse oxidativo. Esta técnica é versátil e pode ser adaptada para examinar a dinâmica citoesquelletal sob uma ampla gama de condições. Além disso, a aquisição e análise de dados são realizadas utilizando equipamentos de laboratório comuns e softwares disponíveis livremente.
Compreender os mecanismos de como as células se conectam e se espalham no ECM durante alterações no estado redox pode fornecer uma visão valiosa sobre estados normais e de doenças, como o câncer metastático. Este método pode ser usado para examinar a disseminação e a adesão celular em diferentes condições de cultura celular, linhas celulares dependentes de ancoragem e/oxidantes para responder a uma ampla gama de questões biológicas. Há inúmeros reagentes necessários para executar esta técnica.
Portanto, é essencial que todas as soluções sejam feitas com antecedência antes do início. Em uma capa de fluxo laminar certificada BSL-II, estabeleceu uma placa de 24 poços certificada pela cultura tecidual. Coloque uma tampa de vidro em cada poço.
Rotule a placa de acordo com a figura 1B do protocolo de texto. Em seguida, pipeta 500 microliters da solução de fibronectina em cada poço. Pipeta a solução sobre cada tampalip algumas vezes para garantir um revestimento uniforme e submersão completa.
Cubra a placa com a tampa. Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, remova a placa da incubadora e aspire a solução de fibronectina dos poços.
Lave os poços três vezes usando 500 microliters de 1X PBS por lavagem. Aspire a lavagem final de 1X PBS, e bloqueie poços com 500 microliters de uma solução BSA delipidada de 0,5% a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por um mínimo de 15 minutos. Primeiro, pré-aqueça as soluções necessárias em um banho de água a 37 graus Celsius.
Em uma capa de fluxo laminar certificada BSL-II, comece com uma monocamada confluente de células REF52 em um prato de 10 centímetros quadrados e lave as células duas vezes com seis mililitros de PBS 1X quente. O soro esflou as células por pelo menos uma hora em seis mililitros de solução BSA deslipidada quente. Em seguida, lave as células com seis mililitros de PBS 1X aquecidos.
Aspire o PBS e adicione 1,5 mililitros de solução 0,5% de trypsin-EDTA. Incubar as células a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por aproximadamente dois minutos. Observe as células sob um microscópio leve para garantir que o destacamento esteja completo.
Se as células ainda estiverem aderentes depois de tocar a placa na parte superior do banco, devolva-as à incubadora por mais dois minutos. Pipeta 1,5 mililitros de solução de neutralização de trippsina quente, TNS, para o prato para parar a experimentação e coletar células separadas. Pipeta a solução para cima e para baixo sobre a parte inferior da placa inúmeras vezes para remover todas as células aderentes restantes.
Se as células parecerem desajeitadas, triturar ainda mais a suspensão da célula, estotinando suavemente para cima e para baixo sobre a parte de trás do prato. Em seguida, conte as células usando a exclusão azul trypan em um contador de células automatizada. Remova uma quantidade apropriada de células para criar uma suspensão celular com a densidade celular entre 10.000 e 30.000 células por mililitro em BSA delipidado em um tubo cônico de 15 mililitros.
Use um rotor de ângulo fixo em uma centrífuga de mesa para centrifugar as células a 300 vezes g durante cinco minutos. Aspire o supernasal e suspenda a pelota de célula em sete mililitros de solução BSA deslipidada quente. Em seguida, divida uniformemente a suspensão celular em dois tubos cônicos de 15 mililitros, um para controle sozinho do veículo e outro para Ku55933.
Usando um rotador de tubos, gire os tubos por 90 a 120 minutos em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius. 30 minutos antes de emplacamento, adicione Ku55933 e DMSO a cada tubo a uma concentração final de 10 micromolar. Devolva a suspensão do celular ao rotador pelo tempo restante.
Imediatamente antes de emplacar as células, recupere a placa da incubadora e aspire a solução BSA delipidada. Depois disso, remova 500 microliters da suspensão celular de cada grupo de tratamento e adicione cada um a um dos deslizamentos de cobertura revestidos de fibronectina na placa de 24 poços. Continue incubando a placa e a suspensão celular nas condições anteriores.
Em seguida, permita que as células aderam ao deslizamento de cobertura pelo tempo desejado. Após o tempo desejado para adesão ter passado, aspire a solução celular de cada deslizamento de cobertura na placa. Distribua suavemente 500 microliters de solução de 3,7% de paraformaldeído em cada deslizamento de cobertura, pipetando pelos lados dos poços, e espere de 10 a 15 minutos.
Em seguida, remova a solução de paraformaldeído e lave cada tampa duas vezes com 1X PBS usando 500 microliters de PBS por lavagem. Aspire o PBS e as células permeabilizadas em cada fenda com 500 microliters de 0,2%Triton X-100 e 1X PBS por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave cada tampa três vezes com 1X PBS usando 500 microliters de PBS por lavagem.
Bloqueie as células em cada tampa com 500 microliters de tampão de bloqueio de imunofluorescência por 30 a 60 minutos. Diluir o anticorpo anti-paxillin primário no buffer de bloqueio em uma proporção de 1 a 250. Misture bem e adicione 200 microliters da solução de anticorpos a cada deslizamento de cobertura.
Incubar em temperatura ambiente por pelo menos uma hora. Depois disso, aspire a solução de anticorpos e lave cada tampa com 500 microliters de 1X PBS por 10 minutos. Proteja as amostras da luz deste ponto em diante.
Diluir a sonda F-actin de fhalloidina conjugada ao corante alexa 594 fluorescente vermelho e ao anticorpo secundário fluorescente de cabra 488 na mesma solução tampão de bloqueio. Misture bem e adicione 200 microliters da solução de anticorpos a cada tampa por 30 minutos. Aspire a solução de anticorpos e lave cada tampa com 500 microliters de 1X PBS por 10 minutos.
Aspire o PBS e enxágue as tampas uma vez com 500 microliters de água deionizada. Em seguida, fixe os deslizamentos de cobertura em slides de microscópio usando meio de montagem anti-fade contendo DAPI. Após fixação e coloração com um anticorpo anti-paxillin, imagens fluorescentes de 8 bits em escala de cinza das células REF52 são adquiridas.
Após a conclusão de todas as etapas de processamento de imagem, as aderências focais individuais devem ser proeminentes, em foco e facilmente distinguíveis umas das outras. Imagens de fluorescência em escala de cinza de células manchadas de sonda f-actin anti-paxillin e fhalloidina f-actin são então tiradas após serem banhadas em fibronectina. Aderências focais proeminentes e fibras de estresse devem ser facilmente visíveis nas células REF52 depois de serem autorizadas a aderir à fibronectina por 20 a 30 minutos.
Babados enriquecidos com f-actina na borda principal das membranas celulares são indicados com uma seta. Imagens fluorescentes similares da sonda F-actin de fhalloidina e da coloração anti-paxillin são analisadas para a porcentagem de fibras de estresse na propagação celular. Notavelmente, o tratamento oxidante causa um aumento significativo na formação de fibras de estresse em todos os pontos de tempo de adesão examinados, e uma diminuição na propagação celular após 15 minutos de adesão celular à fibronectina.
O revestimento em densidades celulares mais altas leva à aglomeração celular que proíbe que as células se espalhem completamente devido à superconfluência. Observe que as bordas das células são indistinguíveis das células adjacentes. Como resultado, a quantificação de células individuais é impedida e a circunferência disseminada não pode ser determinada com precisão.
Uma linha celular separada de fibroblastos embrionários de camundongos são mantidos em suspensão e, em seguida, banhados em fibronectina por 30 minutos. As células foram então fixadas e manchadas com um anticorpo anti-paxillin. Note as células fora de foco.
Além disso, a reatividade cruzada do anticorpo anti-paxillin com detritos celulares alterará o limiar durante a análise quantitativa da imagem e não deve ser incluída na análise. Durante o processamento da imagem, use a ferramenta de procuração em Fiji para examinar o histograma da imagem enquanto ajusta o brilho/contraste para evitar armadilhas relacionadas à saturação do sinal. Mudanças na adesão e disseminação podem influenciar a migração celular.
Métodos para rastrear a migração de células únicas, a cicatrização de feridas ou os ensaios de invasão de quimiotaxis podem determinar se alterações na migração estão ocorrendo. GtPases da família Rho regulam a dinâmica de adesão celular através de sua ativação temporal espacial específica. Mudanças fenotípicas na adesão e disseminação durante o estresse oxidativo podem ser sugestivas de papéis regulatórios a jusante para essas proteínas.
Este método requer o uso de linhas celulares BSL-II e reagentes químicos perigosos. Os pesquisadores necessitam de treinamento em segurança química e biológica, conforme determinado pelo escritório de saúde e segurança ambiental de sua instituição.
