Oferecemos produzir células sanguíneas a partir de células-tronco pluripotentes humanas. A principal vantagem desta técnica é que temos rendimentos consistentes e precisos de células endoteliais hemogênicas. Esperamos que nossa plataforma permita amplas aplicações no monitoramento e triagem de doenças para compostos terapêuticos.
Esta técnica é particularmente benéfica para a pesquisa de hematologia e imunologia. O método pode ser aplicado à intervenção genética ou edição de genes de células sanguíneas humanas. Permite a fácil indução de vetores em células endoteliais hemogênicas.
O ponto mais crucial é o revestimento LM511-E8 para digitar colônias de PSC. Não recomendamos pular o revestimento ou substituir por outra matriz. Demonstrações visuais são importantes porque queremos mostrar como enxaguar as células com um tampão de dissociação e como revestir placas com LM511-E8.
Cresça células-tronco pluripotentes humanas ou hPSCs para entre 70 e 80% de confluência em uma placa de seis poços revestida de LM511-E8 no meio mTeSR1. Quatro dias antes da indução hemogênica, aspire o meio e lave duas vezes com PBS. Enxágüe as células com solução de dissociação e incubar a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Resuspengue as células em meio de manutenção de PSC e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugar as células a 200 vezes G por três minutos. Aspire o supernasce, e resuspense as células em meio de revestimento PSC.
Emplaque a suspensão do PSC de acordo com as instruções do manuscrito em um vaso plástico microfíbrido, e incubar durante a noite. Três dias antes da indução hemogênica, pipeta suavemente os esferoides psc em um tubo cônico de 15 mililitros e deixá-los por dois minutos à temperatura ambiente para precipitar pela gravidade. Aspire o supernatante e resuspenda os esferoides no meio de revestimento esferoide.
Distribua a suspensão em um prato de cultura LM511-E8 revestido de 10 centímetros a uma densidade de quatro esferoides por centímetro quadrado e incubar por três dias. Após três dias, aspire o meio, adicione o meio de diferenciação do dia zero e cultue as células por dois dias em uma incubadora hipoxica. Em seguida, aspirar o dia zero médio, adicionar dia dois meio de diferenciação, e cultura por mais dois dias.
Dois dias depois, aspire o meio e lave as células duas vezes com PBS. Enxágüe as células com solução de dissociação e incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, dissociar as células reutilizando-as suavemente em um EDTA milimôlar.
Transfira a suspensão para um tubo cônico de 50 mililitros e centrífugue as células a 200 vezes G por três minutos. Aspire o supernascer e resuspenja a pelota celular com 300 microliters de tampão de separação magnética. Adicione 100 microlitadores de microesferas CD34 positivas às células e misture suavemente por pipetação.
Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos, depois usar um coador de células de 40 micrômetros para esticar a suspensão e separar as células CD34 positivas usando um separador magnético. Distribua 0,5 mililitros de 5 microgramas por solução de revestimento de fibronectina mililitro em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços, e incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, centrifugar as células CD34 positivas classificadas a 200 vezes G por três minutos, e resuspensar a pelota em um mililitro de meio EHT.
Determine a densidade celular viável com um contador celular, e ajuste a densidade celular para 200.000 células por mililitro adicionando meio EHT. Aspire e descarte a solução de revestimento dos poços revestidos de fibronectina e dispense 0,5 mililitros de suspensão celular CD34 positivo em cada poço. Incubar as células da incubadora hipoxica por uma semana.
Para coletar as células flutuantes, transfira o meio de cultura para um tubo cônico de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes G por três minutos. Em seguida, aspirar o supernaspe. Para coletar as células aderentes, lave-as duas vezes com 0,5 mililitros de PBS e enxágue-as com tampão dissociante.
Aspire o líquido excedente e incubar a placa a 37 graus Celsius por cinco minutos. Resuspense as células em um mililitro de tampão Facs, e misture as células flutuantes e aderentes. Centrifugar as células mistas a 200 vezes G por três minutos, depois aspirar o supernascer e resuspensar as células em 50 microliters de tampão Facs.
Diluir anticorpos anti-CD34 e anti-CD45 em 50 microliters de tampão Facs;adicioná-los às células e incubar as células por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, lave as células duas vezes com PBS, centrifugando a 200 vezes G por três minutos após cada lavagem. Aspire o supernascer e resuspenja as células em 0,5 mililitros de tampão Facs com 0,5 microgramas por dappy mililitro.
Meça a expressão CD34 e CD45 por citometria de fluxo. Para coletar as células hematopoiéticas, transfira o meio de cultura para um tubo cônico de 15 mililitros. Colete as células restantes enxaguando suavemente o poço duas vezes com PBS.
Centrifugar as células a 200 vezes G por três minutos, em seguida, aspirar o supernante e resuspend em um mililitro de meio EHT. Depois de contar as células, adicione 10.000 células a três mililitros de mídia espaçada de metilcelulose, complementadas com antibióticos, e use uma seringa calibre 16 para misturar cinco vezes. Dispense toda a suspensão da mídia em cada poço de uma placa de seis poços.
Para manter as células úmidas, adicione água ou PBS aos poços vazios na placa. Incubar as células por duas semanas, certificando-se de não perturbar o prato, pois as colônias são sensíveis ao movimento. Depois de duas semanas, conte as colônias sob um microscópio.
As células mudam morfologicamente de células endoteliais para hematopoiéticas após a estimulação com o coquetel hematopoiético. Colônias de células hematopoiéticas emergem na cultura. Células progenitoras hematopoiéticas expressam CD34 e CD45, por isso a citometria de fluxo é usada para confirmar a presença de colônias de células hematopoiéticas analisando a expressão de CD34 e CD45.
Um ensaio de unidade formadora de colônias demonstrou a geração de granulócitos ou colônias de macrófagos das células progenitoras hematopoiéticas CD34-positivo e CD45 positivo. O número da colônia foi estimado em 38 unidades formadoras de colônias por 10.000 células. Os passos mais cruciais são a contagem de esferoides de PSC.
Descobrimos que a métrica da superfície é o fator mais determinístico na eficiência deste protocolo. Este procedimento pode ser seguido pela produção fora da prateleira de células ineréricas, como células de ocorrência natural e macrófagos. Esta plataforma permite que os pesquisadores explorem fatores determinísticos chave no desenvolvimento hematopoiético humano.
