Os protocolos aqui apresentados foram otimizados para a cultura 3D e permitem uma investigação eficiente e acessível dos processos associados ao crescimento, proliferação e morte de células cancerígenas em um ambiente 3D. As principais vantagens do uso da cultura 3D é que eles são uma possibilidade única para recapitular aspectos-chave do microambiente tumoral in vitro. O spheroid 3D é uma importante ferramenta para o rastreamento de medicamentos contra o câncer, que está sendo cada vez mais usado para melhorar a tradução entre condições in vitro e in vivo em pesquisas de terapia contra o câncer.
Alguns dos protocolos exigem uma certa quantidade de prática e habilidade. Isso é, em particular, verdadeiro para a produção de esferoides pelo método de queda de mão, e para incorporar esferoides para imunohistoquímica. Como elementos-chave desses procedimentos são difíceis de descrever por escrito, como inserir esferoides em uma gota de agarose, a demonstração visual ajudará os pesquisadores a realizar esses procedimentos.
Diluir a suspensão celular preparada em um tubo de 15 mililitros para obter a densidade celular ideal. Transfira a suspensão da célula diluída para um reservatório estéril e use uma pipeta multicanal para distribuir 200 microliters na placa previamente preparada. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade.
A cada dois ou três dias, adquira imagens microscópicas leves dos esferoides. Após a aquisição das imagens, remova 100 microliters do meio gasto de cada poço, e substitua-o por 100 microliters de meio fresco. Primeiro, descongelar membrana reconstituída no gelo.
Mantenha todas as placas e reservatórios embrulhados individualmente no gelo antes de usar. Em seguida, diluir a suspensão celular preparada em um tubo de 15 mililitros para obter a densidade celular ideal. Coloque o tubo contendo a suspensão celular diluída no gelo.
Encha os recipientes de plástico com gelo e transfira-os para o capô. Transfira as placas e reservatórios refrigerados para um capô de cultura celular. Coloque as placas e reservatórios de volta no gelo.
Resuspenque o rBM suavemente para garantir um gel homogêneo. Adicione a concentração ideal do rBM às suspensões celulares resfriadas. Inverta o tubo para garantir que a suspensão rBM e da célula estejam devidamente misturadas.
Em seguida, transfira essa mistura para um reservatório estéril, e use uma pipeta multicanal para distribuir 200 microliters para cada poço de uma placa de 96 poços refrigerado, ultra-baixa. Centrifugar a placa a 750 vezes g por 15 minutos para garantir que as células estejam agrupadas quando o rBM endurecer. Use a centrífuga de descida suave ou função de frenagem mínima.
Primeiro, adicione seis mililitros de PBS a um prato de cultura celular. Diluir a suspensão celular preparada para obter uma diluição adequada. Uma diluição prática é de 50.000 células por mililitro.
Despeje a suspensão da célula em um reservatório estéril e use uma pipeta multicanal para colocar cuidadosamente até 30 gotas de suspensão na tampa do prato de cultura celular, resultando em uma concentração de 2000 células por gota. Em um movimento rápido, mas controlado, inverta a tampa e coloque-a em cima do prato de cultura celular contendo PBS. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade por quatro a seis dias.
Se os esferoides forem usados para lises proteicas ou incorporação, puxe-os removendo a tampa, inclinando-a e, em seguida, lavando as gotas com um mililitro de mídia aquecida. Transfira o meio esferoide resultante para um tubo de 1,5 mililitro. Deixe o spheroid se acomodar no fundo do tubo antes de prosseguir com lises proteicas ou incorporação.
Corte a ponta de uma pipeta P200 para capturar mais facilmente os esferoides sem perturbar sua estrutura. Para cada condição, puxe um mínimo de 12, mas idealmente entre 18 e 24 esferoides em um tubo de 1,5 mililitro. Coloque os tubos no gelo e deixe os esferoides se instalarem na parte inferior.
Em seguida, passe do laboratório de células estéreis para o laboratório regular. Lave os esferoides duas vezes em um mililitro de um X PBS gelado, certificando-se de deixar os spheroids se acomodarem antes de remover o PBS entre cada etapa de lavagem. Em seguida, aspire o máximo de PBS possível sem perturbar ou remover os esferoides.
Adicione cinco microliters de tampão de lise aquecida com fosfattase e inibidores de protease por esferoide. Vórtice os esferoides por 30 segundos e, em seguida, realizar uma centrifugação rápida por 10 segundos. Repita esses intervalos de vórtice e centrifugação por cinco a 10 minutos, ou até que os esferoides sejam dissolvidos.
Depois de preparar a solução PI, remova 100 microliters de meio de cada poço na placa de 96 poços, certificando-se de não remover os esferoides. Adicione 100 microliters de um X PBS aquecidos a cada poço, seguido pela remoção de 100 microliters de líquido dos poços. Repita esta etapa de lavagem três vezes para lavar qualquer meio restante.
Em seguida, adicione 100 microliters da solução PI a cada poço. Cubra a placa em papel alumínio e incubar por 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade por 10 a 15 minutos. Depois disso, repita o processo de lavagem com um X PBS aquecido três vezes, como descrito anteriormente, para lavar a solução PI e diminuir o sinal de fundo ao fotografar.
Usando um microscópio de epifluorescência, imagem dos esferoides. Dentro do software de imagem, abra o menu multicanal. Defina o tempo de exposição para os canais relevantes e pressione As Configurações de leitura após ajustar cada canal.
Abra o menu Z-stack e defina o início e o fim ajustando o foco da imagem. Inicialmente tenha o esferoide fora de foco, em seguida, mova o ponto focal através de todo o esferoide até que a imagem fique embaçada mais uma vez. Em seguida, ajuste o tamanho da etapa para ficar entre 18 a 35 micrômetros e pressione Iniciar.
Para começar, fixe os esferoides em um capô de fumaça no primeiro dia, conforme descrito no protocolo de texto. No segundo dia, coloque o gel de agarose em um béquer cheio de água em um forno de micro-ondas para aquecê-lo e manter o gel aquecido em uma placa de aquecimento de bancada definida a 60 graus Celsius, até que seja necessário. Lave os esferoides duas vezes no capô da fumaça usando um mililitro de um X PBS gelado por lavagem.
Então, aspirar a maior parte da PBS. Prepare uma ponta de pipeta de 20 microliter cortando-a em uma inclinação para obter uma ponta mais pontiacção com um orifício maior. Depois disso, faça uma queda de gel de agarose em um slide de microscópio.
Coloque o slide em um bloco de aquecimento quente para evitar que a agarose se solidifique. Usando a ponta de pipeta modificada, pegue o máximo de esferoides possível em um volume de 15 a 20 microliters. Injete cuidadosamente os esferoides no centro da queda do gel agarose, certificando-se de não tocar no slide do microscópio.
Incubar à temperatura ambiente ou a quatro graus por cinco a 10 minutos para deixar o gel agarose endurecer. Quando a gota de gel se solidificar um pouco, mas ainda estiver bastante macia, use um bisturi para empurrá-lo cuidadosamente do deslizamento do microscópio em uma fita de tecido plástico. Transfira o de tecido para um béquer cheio de etanol e armazene em temperatura ambiente.
Neste estudo, uma série de métodos são apresentados para a análise de alterações induzidas pelo tratamento anticâncológico na viabilidade e morte de células cancerosas na cultura 3D. A concentração de rBM adicionada pode afetar profundamente a morfologia dos esferoides. A adição de até 2,5% de rBM permite a formação de esferoides em células cancerígenas de mama SKBr-3, sem efeito adicional em concentrações mais elevadas.
Em contraste, as células cancerígenas pancreáticas BxPC-3 formam espontaneamente pequenos esferoides compactos. Neste tipo de célula, o aumento do rBM para 1,5% ou mais provoca uma mudança morfológica distinta de esferoide para estruturas mais convolucidas com saliências e invaginações. Um exemplo do uso de culturas esferoides para a triagem da eficácia da quimioterapia é mostrado aqui.
Imagens de microscópio leve são adquiridas a cada dois ou três dias durante um experimento de resposta a doses realizado para determinar a dose necessária para 50% de viabilidade reduzida em células cancerígenas de mama MDA-MB-231. O arranjo espacial de células mortas sobre uma concentração crescente de um inibidor pode ser visualizado usando a coloração de PI. Como visto, os spheróides de controle mostram um núcleo apoptótico limitado, tardio, enquanto as células mortas são distribuídas por todo o esferoide à medida que a concentração do inibidor é aumentada.
A técnica esferoide mostrada aqui pode ser aplicada a muitos outros ensaios, como invasão 3D, migração ou análise microphoretic. Também é aplicável para co-culturas com fibroblasto, adipócitos ou células imunes, que podem fornecer informações importantes sobre interações celulares no microambiente tumoral. O desenvolvimento dessa técnica tem sido muito importante na elucidação do papel do microambiente tumoral em inúmeros aspectos do desenvolvimento do câncer, incluindo expressão genética, invasão e assistência ao tratamento.
