O protocolo atual é significativo porque permite que os pesquisadores produzam nanopartículas carregadas de siRNA e caracterizem adequadamente essas nanopartículas para garantir sua adequação à administração de animais antes de estudos subsequentes. A vantagem dessa abordagem é produzir nanopartículas que aumentem a biodisponibilidade do siRNA e produzam nanopartículas que são carregadas neutramente e, portanto, adequadas para a administração sistêmica. Essa técnica é impactante porque as nanopartículas de siRNA podem ser aplicadas para tratar uma miríade de doenças que necessitam de administração sistêmica, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e doenças autoimunes, entre outras.
Para começar, dissolva o polímero no etanol a uma concentração de 33,3 miligramas por mililitro e mexa para garantir a dissolução. Em seguida, use uma pipeta para transferir solução de polímero em 10 milimil de ácido cítrico tampão para atingir uma concentração de 3,33 miligramas por mililitro. Adicione água destilada em um tubo contendo RNA de interferência pequena para alcançar uma concentração de 50 micromolar.
Misture o polímero e pequenas soluções de RNA interferindo completamente em um tubo, pipetando para cima e para baixo para obter uma razão de nitrogênio para fosfato de 10. Coloque o tubo em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, adicione um mililitro de 10 milimolar tampão de fosfato no pH oito ao tubo para obter uma concentração de 0,28 miligramas por mililitro e misture suavemente, seja por pipetação ou invertendo o tubo.
Para confirmar que o pH final é neutro, em torno de 7,2 a 7,5, pipeta 10 microliters da pequena solução de nanopartículas de RNA interferindo nas tiras de teste de pH. Primeiro, prepare uma amostra dinâmica de dispersão de luz filtrando um mililitro de pequenas nanopartículas de RNA interferindo na concentração de 0,28 miligramas por mililitro através de filtros de seringa de tamanho de poros de 0,45 micrômetros em um quartzo quadrado ou cuvette de poliestireno. Em seguida, regiso de tamanho e carga superficial usando um instrumento dinâmico de dispersão de luz de acordo com as especificações do fabricante.
Para confirmar o tamanho e a morfologia de pequenas nanopartículas de RNA interferindo usando microscopia eletrônica de transmissão, adicione primeiro cinco microliters de pequena solução de nanopartículas de RNA interferindo filtrada a 0,28 miligramas por mililitro em cada grade TEM. Coloque as grades à temperatura ambiente por 60 segundos. Estaque com papel filtro por três segundos.
Em seguida, adicione cinco microliters de solução de acetato de 3%de urano a cada grade e incubar por 20 segundos. Estada seca por três segundos. Em seguida, coloque as grades em um desiccador para secar durante a noite antes da imagem sob microscopia eletrônica de transmissão.
Para realizar o retardo de gel de agarose, primeiro adicione dois gramas de pó de agarose de grau eletroforese a 100 mililitros de tampão 1X Tris-acetato-EDTA em pH oito em um béquer para produzir gel de 2%agarose. Mexa para suspender a agarose. Coloque o béquer descoberto em um micro-ondas para aquecer por um a três minutos até que toda a garose seja dissolvida.
Uma vez resfriado, adicione cinco microliters de brometo de etídio na concentração de 10 miligramas por mililitro no béquer e misture bem. Em seguida, despeje a agarose em uma bandeja de gel e coloque o pente para produzir poços. Deixe o gel secar por 30 minutos.
Remova cuidadosamente o pente para deixar para trás os poços de carregamento e despeje o tampão 1X Tris-acetato-EDTA na bandeja de gel para encher até a linha de enchimento máxima. Em seguida, coloque duas alíquotas de microliter de corante de carga sem SDS ou agentes redudores em filme de parafina para cada pequena formulação de nanopartículas de RNA interferindo em diferentes razões de nitrogênio para fosfato. Pipeta para misturar 10 microliters de pequena solução de nanopartículas de RNA interferindo com corante de carregamento em filme de parafina.
Adicione a mistura aos poços de gel agarose. Conecte o sistema de eletroforese a uma fonte de alimentação e execute a 100 volts por 35 minutos ou até que as amostras tenham atravessado 80% do comprimento do gel. Transfira o gel da bandeja para um transilluminador UV e visualize as pequenas bandas de RNA interferindo no transilluminador UV de acordo com as especificações do fabricante.
Determine a razão ideal de nitrogênio para fosfato com base no desaparecimento de pequenas bandas de RNA interferindo na parte inferior do gel. Para derrubar a luciferase genética modelo, as primeiras células expressas da luciferase em uma placa murada 96-bem preta com DMEM em 10% FBS a uma densidade de 2.000 células por poço. Coloque a placa em uma incubadora durante a noite para permitir que as células aderam.
Pela manhã, remova a mídia e adicione 10 microliters por poço de pequenas nanopartículas de RNA interferindo diluídas em mídia de soro total para uma concentração final de RNA interferindo de 100 nanomolar. Devolva os poços à incubadora por 24 horas para tratar as células com pequenas nanopartículas de RNA interferentes. No dia seguinte, substitua a mídia de soro total contendo 150 microgramas por mililitro D-luciferina.
Incubar as células à temperatura ambiente por cinco minutos antes de medir a luminescência em um leitor de placas. Em seguida, repita o refresco da mídia duas vezes com mídia de soro total fresco livre de D-luciferin, seguido de incubação por 24 horas. Substitua a mídia por mídia de soro completo contendo 150 miligramas por mililitro D-luciferin e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos.
Meça a luminescência no ponto de tempo de 48 horas. Para estudos longitudinais, deixe a tampa em cima da placa do poço quando fora do armário de biossegurança para manter as células em condições estéreis e continuar a incubação depois de substituir a mídia contendo luciferina por mídia completa fresca. Medições dinâmicas de dispersão de luz mostram que pequenas nanopartículas de RNA interferindo têm um diâmetro médio de 35 nanômetros.
A presença de um único pico com largura de pico estreita indica distribuição unimodal e baixa polidispersidade. As medições tem confirmam a medição de tamanho da dispersão dinâmica da luz sugere a presença de uma população uniforme de pequenas nanopartículas de RNA interferindo e revelaram a morfologia esférica das pequenas nanopartículas de RNA interferindo. A concentração muito alta de polímero na etapa de preparação resultou em pequenas nanopartículas de RNA interferindo dois em diâmetro indesejável de maior que 200 nanômetros, uma população multimodal e polidispersada, e agregados em solução que não forma morfologia de partículas distintas.
Ambas as pequenas nanopartículas de RNA interferentes um e dois exibem carga de superfície neutra indicada por valores potenciais de zeta médias próximas a zero. O ensaio de retardo de gel de Agarose mostra o desaparecimento de pequenas bandas de RNA interferindo no fundo do gel, o que indica a complexidade do RNA de interferência pequena para o polímero. O RNA de pequenas interferências do polímero é incapaz de migrar através do gel e, portanto, é visualizado na parte superior do gel nas proximidades dos poços de carregamento.
À medida que a razão nitrogênio para fosfato é aumentada, a pequena complexidade de RNA interfere, aumenta conforme indicado pela diminuição da intensidade da pequena banda de RNA interferindo no fundo do gel. A pequena nanopartícula de RNA interferente bioativa apresenta uma atividade de luciferase significativamente diminuída quando comparada ao controle mexido. Em contraste, a pequena nanopartícula de RNA interferindo não é considerada bioativa.
Para produzir nanopartículas siRNA consistentes com propriedades físico-químicas desejadas, deve-se utilizar soluções de polímeros com concentrações adequadas e validar o pH das soluções tampão em cada etapa do protocolo. Usando esses métodos em nossa pesquisa, conseguimos produzir terapias baseadas em nanopartículas de siRNA para genes que causam câncer anteriormente indisciplinados e testar a eficácia dessas terapias em modelos pré-clínicos de câncer de mama.
