Foi bem estabelecido que as estruturas de muitas proteínas estão estabilizadas em ligações de dissulfeto covalente. Em trabalhos recentes, este vínculo foi classificado como uma modificação pós-translacional. Assim, é importante ser capaz de identificar complexos multimer estabilizados por cisteína em células vivas usando um método rápido e simples.
A principal vantagem dessa técnica é que os resultados podem ser obtidos e interpretados de forma rápida, fácil e com custo mínimo. Para começar, cresça células de OS U-2 em um prato de seis centímetros quadrados em Mínimo Essencial Médio High Glicose, suplementado com 10% FBS e 1% piruvato de sódio a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Faça um estoque fresco de iodoacetamida de 10 milimôe pouco antes de usar.
Depois que as células atingirem 50 a 60% de confluência, adicione 0,1 milimão de concentração final iodoacetamida diretamente à mídia de cultura celular. Balance suavemente o prato em temperatura ambiente por dois minutos. Em seguida, aspire a mídia das células, e lave as células com cinco mililitros de PBS frio três vezes.
Aspire a solução final de lavagem PBS e adicione um mililitro de PBS frio. Raspe as células do fundo do prato usando um raspador de células. Usando uma pipeta de um mililitro, elas desenhe a PBS e a suspensão celular e distribua todo o líquido em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Gire as células a 7.500 vezes g em quatro graus Celsius por três minutos. Aspire o PBS deixando a pelota de celular para trás. A pelota celular pode ser armazenada a menos 80 graus Celsius até o processamento.
Para extrair a proteína, prepare 100 microliters de um tampão de lise 1X diluído em água dupla destilada. Adicione PMSF imediatamente antes de usar a uma concentração final de um mililitro. Em seguida, adicione 50 microliters do tampão de 1X lysis diretamente à pelota celular e suspenda novamente.
Incubar o extrato no gelo por cinco minutos. Sonicate por oito segundos usando o modo de pulso constante a 40% mantendo o extrato no gelo. Gire o extrato a quatro graus Celsius e 16.000 vezes g por cinco minutos.
Realize a análise de Bradford para determinar a concentração proteica, se desejar. Para preparar a amostra, pegue 10 microliters do extrato de proteína solúvel e adicione 10 microliters de um tampão amostral de SDS laemmli 1X. Mantenha as amostras no gelo.
Aqueça a amostra a 85 graus Celsius durante cinco minutos antes de executar o gel. Para iniciar a ligação cruzada do formaldeído, cresça células de SO U-2 em um frasco de 175 centímetros quadrados para 70 a 80% de confluência. Em um capô de fumaça adicione o formaldeído fixador diretamente ao meio a uma concentração final de 1% e incubar à temperatura ambiente com agitação suave por 15 minutos.
Para saciar a reação adicione 1,25 glicina molar a uma concentração final de 0,125 molar e incubar à temperatura ambiente com agitação suave em um roqueiro por cinco minutos. Lave as células com cinco mililitros de PBS frio três vezes. Aspire a solução final de lavagem PBS e adicione 10 mililitros de PBS.
Raspe as células do fundo do frasco usando um raspador de células. Usando uma pipeta de 10 mililitros, elas desenhe a PBS e a suspensão celular e distribua todo o líquido em um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros. Gire as células a 500 vezes g e quatro graus Celsius por dois minutos.
Aspire o PBS deixando a pelota de celular para trás. Prepare 10 mililitros do tampão de homogeneização adicionando 0,25 de sacarose molar, um EDTA mililitro, 10 mililitros HEPES e 0,5%BSA no pH 7.4. Imediatamente antes do uso, adicione PMSF a uma concentração final de um mililitro e três mililitros do buffer de suspensão dos núcleos.
Adicione cinco mililitros do tampão de homogeneização diretamente à pelota celular e resuspend completamente. Centrifugar a suspensão a 500 vezes g e quatro graus Celsius por dois minutos. Após a centrifugação, descarte o supernasciente e resuspenque a pelota em cinco mililitros do tampão de homogeneização.
Em seguida, com um vidro apertado, o homogeneizador Teflon homogeneiza as células a 10 tempos por 500 RPM e centrifugar a suspensão a 1.500 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Após a centrifugação descarte o supernasce. Resuspenda a pelota em um mililitro do tampão de suspensão dos núcleos e incubar no gelo por 10 minutos.
Após a incubação, centrífuga a 600 vezes g por 10 minutos. Após a centrifugação, descarte o supernasciente, resuspenque a pelota em um mililitro do tampão de suspensão dos núcleos e centrífuga novamente. A última pelota será os núcleos isolados.
Extrair as proteínas como descrito antes de adicionar 25 microlitadores do tampão de 1X lysis diretamente à pelota celular. Em seguida, prepare duas amostras para a PÁGINA SDS, pegando 10 microliters cada um do extrato de proteína solúvel e adicione 10 microliters de tampão amostral 2X Laemmli SDS e um microliters de BME. Aqueça uma amostra a 37 graus Celsius por cinco minutos e a segunda amostra a 98 graus Celsius por 15 minutos para reverter o cruzamento do formaldeído.
Prepare um litro de tampão de corrida 1X Tris-glicina misturando 25 mililitros Tris, 192 milimolar de glicina e 0,1% de peso por volume SD. Em seguida, configure o aparelho de execução do SDS PAGE. Abra o pacote TGX SDS-PAGE 16% pré-moldado de acordo com o protocolo do fabricante e remova o. Remova o pente que está forrando os poços e a fita da parte inferior do e coloque o gel no aparelho de corrida.
Encha a câmara com o tampão de 1X funcionando até que os poços estejam submersos em líquido. Usando uma pipeta de plástico enxágue os poços com tampão de corrida. Carregue as amostras no gel junto com 10 microliters do marcador padrão pré-manchado.
Por fim, execute o gel a 200 volts até que a frente de corante esteja a aproximadamente um centímetro da parte inferior do gel. Uma análise ocidental de extratos celulares totais na ausência de agente redutor de BME demonstrou uma formação multimérica complexa em diferentes populações de células humanas. O complexo desapareceu com a adição de BME em todas as quatro linhas celulares examinadas, indicando a presença de uma ligação dissulfeto.
A confirmação monomérica de dUTPase em células humanas no momento da colheita é uma combinação de pelo menos três dos isóformes de dUTPase: a isoforme mitocondrial, a isoforma nuclear e uma versão truncada anotada em M24. O isoforme mitocondrial usado como controle não formou uma ligação dissulfeto e migrou para o peso molecular previsto para a proteína monomérica. A inter ligação do formaldeído do dUTPase nuclear demonstrou formação multimérica do complexo.
Quando o cross-link foi invertido incubando a amostra a 95 graus Celsius por 15 minutos, o complexo foi desestabilizado e pôde ser visualizado em seu estado monomérico. Adicionar iodoacetamida é um passo importante neste procedimento para bloquear os resíduos livres de cisteína e garantir que as ligações de dissulfeto não sejam uma consequência do procedimento de extração. É importante lembrar de não adicionar nenhum agente redutor, como BME ou DDT às suas amostras SDS-PAGE, pois elas reduzirão quaisquer ligações de dissulfeto presentes em sua amostra.
