O HPV RNA CISH permite a detecção de uma infecção ativa do vírus do papiloma humano. Uma vez que a hibridização in situ tem como alvo o HPV RNA esta técnica permite a visualização de uma transcrição ativa do vírus. Tem resolução espacial precisa e bom desempenho de diagnóstico.
A detecção do HPV pode apoiar o diagnóstico de várias lesões relacionadas ao HPV, como carcinoma de células escamosas orofaríngeas ou neoplasia cervical. Também pode ter uma influência no prognóstico. Depois de preparar buffers e reagentes de contra-coloração, prepare um reagente de recuperação de alvo x em um grande béquer adicionando 70 mililitros de reagente de recuperação de alvo de 10x a 630 mililitros de água destilada.
Coloque o béquer em uma placa de aquecimento com agitador magnético e cubra-o com papel alumínio. Ferva seu conteúdo a 100 graus Celsius por 10 a 15 minutos, certificando-se de não fervê-lo por mais de 30 minutos. Para bloquear a atividade peroxidase em lâminas com seções de tecido previamente desparafinadas e colocadas no rack de slides, adicione quatro a seis gotas, apenas o suficiente para cobrir a amostra, de peróxido de hidrogênio em cada slide, e incuba-los por 10 minutos à temperatura ambiente.
Lave os slides duas vezes por dois minutos em água destilada à temperatura ambiente. Para quebrar os limites do tecido RNA nas seções de tecido RNA, primeiro remova a folha de alumínio do 1 x TRR fervente usando uma garra e pare de mexer. Mergulhe o rack de slides lentamente e com muito cuidado.
Cubra o béquer novamente com a folha de alumínio e incubar por 15 minutos. Use a garra para transferir imediatamente o rack de lâmina quente para um banho de água destilado e lave-o por dois minutos. Lave os slides em 100% de etanol fresco por dois minutos, e deixe-os secar em temperatura ambiente por dois minutos.
Em seguida, use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar uma barreira em torno de cada amostra, e deixe-a secar por pelo menos cinco minutos. Para digestão protease, coloque os slides na bandeja controlada pela umidade e adicione aproximadamente quatro gotas de Protease Plus por amostra. Cubra a bandeja com uma tampa e insira-a no forno de hibridização por 30 minutos a 40 graus Celsius.
Retire a bandeja do forno e remova o rack de slides. Trabalhando um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque o slide no rack de slides submerso em um prato de coloração cheio de água destilada. Lave os slides duas vezes por dois minutos em água destilada à temperatura ambiente com agitação constante.
Para iniciar a hibridização, toque e aperte os slides para remover qualquer excesso de líquido e coloque-os de volta no rack de slides. Remova a sonda HPV pré-aquecida do forno e adicione aproximadamente quatro gotas para cobrir completamente cada seção. Cubra a bandeja com a tampa e insira-a no forno por duas horas a 40 graus Celsius.
Após completar a incubação, retire a bandeja do forno e remova o rack de slides. Um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque o slide no rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com um tampão de lavagem x, lavando os slides por dois minutos em temperatura ambiente com agitação constante, e repita com um tampão de lavagem x fresco. Toque e filme para remover qualquer excesso de líquido dos slides e coloque-os novamente no rack de slides.
Adicione aproximadamente quatro gotas de temperatura ambiente AMP1 por seção para cobrir inteiramente cada seção. Cubra a bandeja com a tampa e insira-a no forno por 30 minutos a 40 graus Celsius. Depois de remover a bandeja do forno, remova o rack de slides.
Trabalhando um slide de cada vez, remova rapidamente qualquer excesso de líquido e coloque o slide no rack de slides submerso em um prato de coloração preenchido com um tampão de lavagem x, lavando por dois minutos em temperatura ambiente com agitação constante e repita com um tampão de lavagem x fresco. Dispense o mesmo número de gotas de cada solução DAB-A e DAB-B em um tubo de tamanho apropriado para fazer aproximadamente 120 microliters de substrato DAB por seção e vórtice. Pegue cada slide, um de cada vez, do rack de slides, toque e bata para remover o excesso de líquido e coloque-o de volta no rack de slides.
Pipeta aproximadamente 120 microliters de mistura DAB em cada seção de tecido, certificando-se de que as seções estão cobertas. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente, e proceder com contra-retenção. Coloque uma gota de meio de montagem por ripa de vidro e, em seguida, coloque as ripas nos slides e deixe-as secas ao ar.
Após algumas horas, prossiga com a avaliação usando um microscópio óptico como descrito no manuscrito. Como descrito aqui no carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, a presença de coloração de punctiforme marrom no citoplasma ou nos núcleos das células tumorais definiu um caso positivo. Os resultados foram divididos em dois escores, RNA CISH alto e baixo escore observado com um objetivo de 20x.
A coloração do escore RNA CISH é considerada baixa quando observada em menos de 50% das células tumorais e cobre menos de 80% da superfície celular. Por outro lado, o escore de RNA CISH é alto quando observado em mais de 50% das células cancerígenas manchadas, ou com a superfície de coloração superior a 80% em mais de 30% das células tumorais. Nunca se deve deixar os slides secarem para hibridização.
Não se esqueça de pré-aqueça a sonda. Para cada amostra, realize um controle positivo e negativo para avaliar a qualidade do RNA.
