Os métodos que descrevemos aqui foram adotados pelo nosso NIH COBRE patrocinado, University of Kentucky Protein Core Facility para ajudar pesquisadores a produzir anticorpos de domínio único em alpacas. Anticorpos de domínio único são uma ferramenta importante usada para responder a perguntas-chave em pesquisas biomédicas. A principal vantagem das técnicas que demonstramos é que permite a produção de anticorpos de domínio único para até cinco proteínas distintas em uma única alpaca.
As implicações dessa técnica se estendem à saúde humana e ao tratamento de doenças, uma vez que esses anticorpos de domínio único podem ser usados como terapêutica, como vacinas e diagnósticos. O obstáculo mais significativo para os investigadores biomédicos mais estabelecidos é o manuseio de animais de grande porte, como a alpaca. A demonstração visual do manuseio de uma alpaca, a injeção de antígenos e a coleta de sangue são fundamentais para a produção bem sucedida de anticorpos de domínio único nesses cameládes.
Demonstrando o procedimento estarão o Doutor Jeff Smiley, Veterinário Universitário, Kathy Boaz, Técnica Veterinária, e a Srta. Erin Jones, Técnica de Animais de Laboratório. O manuseio do sangue será demonstrado pelo Doutor Martin Chao, Pesquisador Associado. As histórias reais desta produção são Olhos Azuis, Big Boy, ou carinhosamente conhecido como o Gorila, e Freddie, nossas alpacas de Kentucky.
Para começar, contenha o animal com uma cabeçada e chumbo. Em seguida, corte o cabelo da alpaca com cortadores elétricos em um padrão lunar crescente ao longo da base de seu pescoço, de ombro a ombro. Segure cuidadosamente a alpaca pela cabeça e pescoço, e injete lentamente os antígenos subcutâneamente com uma agulha de calibre 22 ao longo da base do pescoço, perto dos linfonodos de arco.
Realize cinco injeções de aproximadamente 200 microliters cada, cerca de cinco centímetros de distância. Depois disso, monitore o animal por cerca de 20 minutos para sinais de anafilaxia. Inspecione o local de injeção para inflamação localizada nos locais de injeção semanalmente.
Para tirar sangue, corte o cabelo da alpaca e desinfete o local de coleta com cotonetes de álcool. Contenha a alpaca suavemente, garantindo que o pescoço seja mantido ereto e reto. Usando as projeções ventral do processo transversal das vértebras como um marco, oclui a veia aplicando pressão apenas medial ao processo ventral.
Em seguida, insira a agulha em um ângulo de 45 graus, ligeiramente medial para a projeção, em direção ao centro do pescoço. Manipule a agulha até o sangue fluir. Primeiro, diluir 15 mililitros do sangue coletado com cinco mililitros de PBS.
Em seguida, pipeta sangue em um tubo de separação linfócito para isolar linfócitos sanguíneos periféricos, ou PBLs, através de centrifugação gradiente de densidade. Remova suavemente a camada de plasma superior, salvando-a em um tubo separado. Em seguida, remova suavemente a camada PBL e transfira-a para um tubo estéril de 50 mililitros.
Adicione 45 mililitros de PBS pré-refrigerados aos PBLs e gire o tubo por 20 minutos a 800 vezes G, e quatro graus Celsius. Remova o supernatante com uma pipeta, deixando a pelota contendo os linfócitos. Lave a pelota mais duas vezes com cinco mililitros de PBS pré-refrigerados para preparar os PBLs para o isolamento do RNA.
Usando este protocolo, anticorpos de domínio único foram gerados contra uma gama de antígenos proteicos. O monitoramento imunológico indicou que a maioria dos antígenos apresentou resposta robusta a partir de três semanas, e que o momento ideal para obter sangue é de seis semanas. Sequenciando as colônias positivas identificou diversas sequências de anticorpos de domínio único para diferentes antígenos.
Por exemplo, três colônias únicas foram isoladas à proteína de ligação de antigens. Geralmente, os anticorpos de domínio único continham uma diversidade de sequência significativa e comprimento altamente variável de laços de ligação de antígeno. Esses recursos são particularmente importantes em interações de anticorpos de domínio único.
Este procedimento permite a produção de anticorpos de domínio único para até cinco antígenos por animal. Uma única coleta de sangue, e construção de biblioteca, é utilizada para cada animal. Com a seleção baseada em exibição de phage utilizada para identificar anticorpos específicos de antígeno e de cadeia única.
Ao fazer as injeções de antígeno e amostragem de sangue, é importante manter as alpacas em grupo, o que as mantém mais calmas. Isso pode ser feito usando cabrestos e cabos, e amarrando-os em proximidade durante os procedimentos.
