O agente trypanosoma cruzi da doença de Chagas pode produzir infecções sintomáticas de longa duração que podem se abrir em patologia reconhecida clínica. A descoberta dos ninhos trypanosoma cruzi no tubo seminiferous de um menino que morreu da doença de Chagas sugere o protocolo de pesquisa para desvendar a possível transmissão sexual dos parasitas chagas. Prestar assistência à saúde pelo período de cinco anos e recrutar as famílias, apresentando participantes com sintomas clínicos da doença aguda de Chagas, ACG.
Obteve 15 ml de sangue venoso de participantes familiares em três ocasiões com um ano de diferença, divididos em três, cinco mil alíquotas e loja em quatro Centígradas. Coletados dois ml do soro ejaculado por voluntários adultos mostram o T.cruzi no sangue dos casos de ACG para validar os ensaios moleculares. Isolar o T.cruzi da alíquota de sangue ACG é armazenado em tubo estéril de 10 ml com anticoagulante.
Inocular cinco ml de sangue em inclinações de tubo de 50 ml mais cinco ml de infusão hepática experimentam meio e incubam em um shaker a 27 Centígrados por três meses. Pesquise microscopia para o T.cruzi em 100 microliter do supernatante no escorregador de vidro. Retire as flagelatas do meio centrifugado a 1.000 x G por 10 min e lavado em PBS pH 7.4.
Inoculação 75 ml L6 cultura muscular cultura frasco cada um com 10 para o sexto T.cruzi isolados. Alimente as células culturais com 15 ml de Dulbecco Minimal Essential Medium, DMEM a 37 Centigrades. Cresça os isolados do parasita e o controle positivo Berenice T.cruzi.
Cresça o T.cruzi relativo Leishmania braziliensis no DMEM como um controle negativo. Use 10 x 10 para a sexta cultura de tecido derivada T.cruzi trypomastigotes para infectar camundongos. Procure os ninhos do T.cruzi nas seções dos músculos e órgãos de reprodução após um mês.
Use as alíquotas de sangue no tubo EDTA Corning estéril de 10 ml e colete as células brancas por centrifugação gradiente de densidade a 3.000 x G por 45 min. Lave as células duas vezes com PBS e centrífuga a 1.500 x G por 10 min em um tubo diferente. Extrair o DNA do isolado enviado da Berenice T.cruzi de L.braziliensis de 109 indivíduos familiares e do espermatozoide de 21 participantes como na etapa 3.3 do protocolo.
Meça as concentrações de DNA em gel de 0,8% agarose e absorvido em 206 nanômetros. Use o T.cruzi TCZ um traço dois primers anneal para a sonda nucleotide 188 na análise PCR. Faça a mistura pcr com 10 DNA modelo de nanograma, 0,4 micromolar de cada par de primers, duas unidades estoque dna polimerase, 0,2 micromolar DNA-TPs, e 5 cloreto de magnésio micromolar em um volume final de 25 microliteres.
Conduza a amplificação do DNA como na etapa 3.5.2 e mostre as bandas de DNA no gel. Use os anneals da sonda t.cruzi 188 para os primers de data com dATP alfa 32P e separe o produto PCR em um gel de 1,3% de agarose e transfira para uma membrana de nylon carregada positivamente. Lave a membrana e agora exponha ao campo de raios-X por períodos variáveis.
Cresça os clones selecionados a partir do campo de raios-X e seque comercialmente com o TCZ um traço dois primers. Realize três ensaios independentes de imunofluorescência e triplicar de uma a 100 diluições de soro na PBS de 109 participantes do estudo. Centrifugar a alíquota de cinco ml do sangue fechado a 1.000 x G por 30 min e armazenar o soro a menos 20 Centígrados.
Executar diluições de soro de imunofluorescência independentes a partir das amostras de estudo obtidas em três ocasiões com um ano de diferença. Use 5 microliteres dos amastigotes T.cruzi formalmente incubados ou promastigotes L.braziliensis, 10 parasitas por microliter em suspensões PBS em deslizamento de vidro e deixe-o secar durante a noite, como na etapa 5.3.3. Incubar o parasita no vidro com 100 microlitadores de uma a 100 diluições de soro e cobrir com deslizamento em uma câmara úmida por uma hora a 37 Centígrados, depois lavar duas vezes com PBS.
Incubar os slides de vidro secos ao ar com uma a 1.000 diluição de um anticorpo de coelho rotulado fluoresceína para IgG humano, lavar e secar também. Monte o slide de vidro com um deslizamento de tampa e examine-o sob o microscópio de luz UV. Detecte o T.cruzi e o antígeno solúvel L.braziliensis um micrograma em 100 microliter de tampão de carbonato pH 9.6.
Incubar com 100 microliter de uma a 100 diluição sérico em poços esquartejados triplicados. Lave as placas duas vezes com soluções PBS-Tween e espere secar. Incubar com 100 microliter de um a 1.000 diluições de conjugado alcalino fosfatese, anti-coelho de cabra IgG.
Lave as placas duas vezes com PBS-Tween, adicione o substrato para-nitrofenylphospate e espere pelo desenvolvimento da cor. Leia as densidades ópticas em 630 nanômetros em um leitor de placas multi mode. Transilluminar ovos de galinha férteis e fazer um buraco na casca em sua bolha.
Inocula 100 trypomastigotes em cada meio de cultura de concha nos ovos de controle simulados. Sele o orifício com fita adesiva. Incubar os ovos em 37 Centígrados, 65% de umidade por 21 dias.
Cultivar os filhotes eclodidos do grupo A de ovos de controle ao vivo a partir dos controles simulados, grupo B e dos ovos inoculados T.cruzi, grupo C até sua vida adulta. Desafie as galinhas dos grupos B e C duas vezes com 10 x 10 para o sétimo tripo de tripulação formalmente incubado semanalmente. Obtenha dois ml de sangue venoso de uma veia de asa das galinhas A, B e C cinco semanas após o desafio.
Separe o soro e execute o analisador de imunofluorescência para detectar o anticorpo T.cruzi. Seguro bem-estar animal com excelente habitação, comida e abastecimento de água. Use o sêmen ejaculado de um adulto, e um caso de doença de Chagas positivo APCR, e de um sujeito de controle como na etapa 1.5 do protocolo.
Incutir 100 alíquotas de sêmen microliter no peritoneal e na vagina de camundongos. A transmissão sexual da infecção por T.cruzi em camundongos parentais e descendentes. A pegada do Trypanosoma cruzi da doença aguda de Chagas mostrada pelos produtos nDNA-PCR que se formam com antecedência com a sonda de rádio rotulada.
O fenótipo do T.cruzi revelou com o ensaio de imunofluorescência. O anti-T. o anticorpo cruzi não reconhece l.braziliensis.
Representação gráfica dos ensaios ELISA e do nDNA-PCR. Grupos um e dois, respectivamente, controle negativo e positivo. Grupo três, nDNA-PCR positivo e os ensaios específicos de anticorpos.
Grupo quatro com as infecções de T.cruzi detectadas pelo nDNA-PCR, mas na ausência do anticorpo específico. Grupo cinco, participantes livres de infecção. Os heredogramas e mapeamento da população familiar apresentaram discrepâncias entre as proporções do anti-T.
anticorpo cruzi e os dos ensaios nDNA-PCR. Aberto é quadrado e círculo, negativo masculino e feminino. Vermelho com anti-T.
anticorpo cruzi e nDNA-PCR positivo. Preto, nDNA-PCR positivo sozinho. A tolerância imunológica em galinhas eclodiu de ovos inoculados de T.cruzi.
A, controle simulado, B, galinhas controladas ao vivo desafiadas com o antígeno T.cruzi. C, as galinhas eclodiram dos ovos inoculados T.cruzi após desafio com o antígeno específico. A infectividade do T.cruzi mostrou-se que o sêmen instila na cavidade peritoneal e na vagina.
Os camundongos sacrificaram três semanas dessas alambiques mostraram o ninho de amastigote no coração, no músculo esquelético, e nos vasos deferidores e no tubo uterino. A transmissão sexual das infecções de T.cruzi no sistema modelo do rato. Os T.cruzi infectaram machos e fêmeas, transmitindo a infecção para companheiros ingênuos.
A infecção por T.cruzi foi transferida verticalmente dos pais para os ratos descendentes. A mancha sulista revelou a banda de anginato parasita na maioria das ninhadas de F1. A mancha de imunoperoxidase T.cruzi amastigotes mostrou engoniablasto e no intersticicial da epidídite e no lúmen de tubos seminiferos dos camundongos progêneros.
A demonstração parasitológica do protozoário em 21 casos agudos da doença de Chagas foi crucial para validar a pegada T.cruzi em todos os indivíduos infectados. As discrepâncias entre as proporções dos ensaios de anticorpos parasitas e os dos testes de ácidos nucleicos revelaram a maioria das pegadas nos pacientes sem anticorpos. A grande diferença explica bem no modelo de frango refletido ao T.cruzi após a primeira semana de desenvolvimento do embrião.
As galinhas adultas de tolerância imunológica mostraram as pegadas de parasitas, mas com a ausência do anticorpo específico. O anti-cruzi vital em Chagas ejaculações do paciente iniciado infecções generalizadas em incutir na vagina do rato e também na cavidade peritoneal. A patologia mostrou os ninhos de amastigote t.cruzi no coração e músculos esqueléticos e nos vasos deferens e no tubo uterino.
A criação de camundongos chagas com companheiros ingênuos revelou que as fêmeas e machos infectados transmitiram o T.cruzi para os companheiros ingênuos não infectados e a maioria de suas ninhadas adquiriu a infecção verticalmente transferida para a prole. O protocolo familiar abordou o ensaio de ácidos nucleicos para realizar transfusões de sangue confiáveis e consultas epidemiológicas e elucidar a potencial doença de Chagas sexualmente transmissível em curso.
