Agradecemos Reata Pharmaceuticals fornecendo CDDO-DFPA. Também reconhecemos o apoio da Jane e Lee Seidman Presidente em inovação de câncer pediátrico (John Letterio). Este trabalho foi financiado pelo departamento de defesa [W81XWH-12-1-0452]; Angie Fowler adolescentes e jovens adultos câncer iniciativa de pesquisa no caso Comprehensive Cancer Center; e o prêmio de estudioso de Callahan graduado de Hsi-Ju Wei da Fundação FJ Callahan.

Todos os estudos foram realizados em conformidade com os procedimentos aprovados do caso Western Reserve University School of Medicine cuidado institucional do Animal e Comitê de uso.
1. preparar células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs)
<ol><li>Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos através de autoclavagem e realizar o experimento em classe II de segurança biológica com procedimentos de segurança adequados.</li>
	<li>Eutanásia em camundongos C57BL/6 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Impostos especiais de consumo ossos tíbia-fíbula e fêmur usando uma tesoura cirúrgica e colocá-los com 70% de etanol em um prato de cultura de 10 cm.</li>
	<li>Use lâminas cirúrgicas e fórceps para dissecar o tecido fora tanto quanto possível na tampa do cm 10 cultura prato e isolar tíbias e fêmures de colocá-los com 70% de etanol em um prato de cultura de 6 cm.</li>
	<li>Use lâminas cirúrgicas para ambas as extremidades de tíbias e fêmures. Use 3 mL de PBS em seringa de 3 ml com agulha 23G para liberar o conteúdo da medula de uma extremidade dos ossos para um tubo cônico contendo 12 ml de PBS. Repita este passo 3 x para cada extremidade dos ossos.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as células com tampão de lise de 1ml ACK para 5 minutos para remover células vermelhas do sangue.</li>
	<li>Adicione 9 ml de PBS para diluir o tampão de Lise ACK e centrifugar 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender com 10 ml de meio de cultura (RPMI 1640 plus L-glutamina, 10% FBS, 1% não-essenciais aminoácidos (x 100), 10 mM HEPES, 50 nM β-Mercaptoetanol e 5% de penicilina/estreptomicina). Nota: O nível de endotoxinas tem que ser menos de 0.1 EU/ml no FBS.</li>
	<li>Passar a suspensão de células através de um filtro de célula 40 μm e levar 20 µ l de suspensão de células e misture com 80 µ l de trypan azul para contar o número de células vivas usando citômetro.</li>
	<li>Ajuste o número de células a 1 x 106 células/ml com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 de 10 ng/ml.</li>
	<li>3 ml de 1 x 106 células/ml em cada poço da placa de 6 a placa e incubar as células em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade a incubadora de CO2 . Nota: As células da medula óssea de um rato é em torno de 3-5 x 107 células, indicando que pode ser colocada de 2 para 3 placas de 6 boas.</li>
	<li>No dia 3, remova todos os 3 ml de meio de cultura de cada poço, adicionar 2 ml PBS fresca em cada poço, e em seguida agite suavemente a placa para garantir a remoção de todas as células não-aderentes.</li>
	<li>Substitua 3 ml de meio de cultura fresco com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 em cada poço de 10 ng/ml. Incube as celulas em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade a incubadora de CO2 .</li>
	<li>No dia 5, diretamente Adicione outro 3 ml meio cultura fresco com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 de 10 ng/ml em cada poço. Incube as celulas em 37° C, 5% de CO2 e 95% de umidade a incubadora de CO2 . Nota: O volume total em cada poço agora é 6 ml.</li>
	<li>No dia 7, coloque o prato inteiro no gelo por 10 minutos. Pipete suavemente o meio de cultura em cada poço para desalojar o frouxamente aderentes BMDCs como os iDCs em suspensão. Nota: Os macrófagos aderentes ainda estão conectados à placa. Procedimentos e suavemente a baixa temperatura são a chave para evitar a ativação de DC para afetar ainda mais experiências.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular de 300 x g, durante 5 minutos e ressuspender com meio de cultura fresco para novas experiências. Nota: BMDCs podem ser identificadas com fluorescência-etiquetada CD11c anticorpo por citometria de fluxo e mostramos nossa estratégia associada de BMDCs para novas experiências na Figura 1.</li>
</ol>2. caracterizar o Gene TolDC e perfil de proteína
<ol><li>Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por bem em 6-placa com meio de cultura na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA para incubar 1 h a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade a incubadora de CO2 . Nota: CDDO-DFPA, um sintético triterpenoides, é um fator nuclear (eritroide-derivado 2) - como - 2 indutor de fator (Nrf2) e inibidor de fator nuclear-κB (NF-κB). Aplicar a outros agentes para indução de TolDCs de iDCs, tais como IL-10, vitamina D3, dexametasona ou Baía 11-7085 e modificar esta etapa para uma condição ideal para cada agente.</li>
	<li>Adicione 10 ou 100 ng/ml de LPS pela incubação 4-24 hrs para induzir mDCs (tempo de incubação é diferente devido a medição do mRNA ou proteína).</li>
	<li>Delicadamente, pipetar o meio de cultura em cada poço e colher a suspensão de células usando uma pipeta de 1 ml. Centrifugar a 300 x g, durante 5 minutos para coletar as células e o sobrenadante, respectivamente.</li>
	<li>Analisar as superfície ligantes de Pelotas o celular por citometria de fluxo, tais como ligantes estimulatórios: CD40, CD80 e CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL ou ligantes inibitórios: PD-L1, L2-PD, ILT3 ILT4.</li>
	<li>Isolar o RNA de Pelotas a célula e analisar o RNA e o sobrenadante amostras para os níveis de citocinas perfil e gene e proteína por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e ELISA, respectivamente. Nota: por exemplo, citocinas inflamatórias: TNF-α, relato, EDN-1, IL-6, IL-12 e IL-23 ou anti-inflamatórios citocinas: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 e HO-1.</li>
</ol>3. avaliar a função de TolDCs In Vitro e In Vivo
<ol><li>
Ensaio de Syngeneic de proliferação de células T
	<ol>
<li>Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos através de autoclavagem e realizar o experimento em classe II de segurança biológica com procedimentos de segurança adequados.</li>
		<li>Prepare o buffer de MACS usando 0,5% albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA em 500 ml de PBS. Esterilize o buffer por filtragem através de um filtro de 0,2 µm. Nota: Mantenha o buffer no gelo durante o experimento a seguir.</li>
		<li>Para obter o CD4+ T células, eutanásia em ratos transgénicos do OT-II T-cell receptor (TCR) 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Isole o baço do lado esquerdo do abdômen com o uso de fórceps e a tesoura cirúrgica.</li>
		<li>Colocar o baço com 2 ml de PBS em um prato de cultura de 6 cm e usar a parte de trás do empurrador da seringa de 3 ml para picar o baço, passando um filtro de célula 40 μm.</li>
		<li>Recolha a suspensão de células e centrifugar 300 x g por 5 min.</li>
		<li>Ressuspender as células em 400 μl de tampão de MACS.</li>
		<li>Adicionar 100 μl de CD4+ T Cell biotina-anticorpo Cocktail a 4° C por 5 minutos. Nota: O anticorpo cocktail vincula em outros tipos de célula, exceto CD4+ T células, tais como CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC-classe II, Ter-119 e TCRγ/δ.</li>
		<li>Adicione 300 μl de tampão de MACS e 200 μl de antigrânulos biotina (Tabela de materiais) a 4° C por 10 minutos.</li>
		<li>Lugar da coluna composta de esferas ferromagnéticas (Tabela de materiais) e filtro de pré-separação juntos no magnético campo e enxaguá-lo com 3 ml de tampão de MACS.</li>
		<li>Adicione 9 ml de tampão de MACS nas células e centrifugar 300 x g por 5 min.</li>
		<li>Ressuspender as células em 3 ml de tampão de MACS e aplique na coluna. Coleta de passagem contendo CD4+ T células.</li>
		<li>Lavar a coluna com outro 3 ml de tampão de MACS e também coletar o escoamento.</li>
		<li>Para obter o pan esplênica DCs, eutanásia em camundongos C57BL/6 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Isole o baço do lado esquerdo do abdômen com o uso de fórceps e a tesoura cirúrgica. Coloque o baço em um prato de cultura de 6cm contendo 2 ml de solução de colagenase D (colagenase 2 mg/ml D dissolvido em HBSS contendo cálcio, magnésio).</li>
		<li>Injecte 1 ml da solução de colagenase D o baço duas vezes com uma seringa de 1 ml e uma agulha de 25G. Corte o baço em pequenos pedaços com uma tesoura pequena.</li>
		<li>Agitar e incubar a temperatura ambiente por 25 minutos.</li>
		<li>Adicione 500 μl de EDTA 0,5 M à temperatura ambiente por 5 minutos. Nota: Os passos de 3.1.13-3.1.14 são essenciais para aumentar o rendimento do DCs.</li>
		<li>Agora use a parte de trás do empurrador da seringa de 3 ml para picar o chorume do baço, passando um filtro de célula 40 μm e coletar a suspensão de células por centrifugação a 300 x g por 5 minutos.</li>
		<li>Ressuspender as células em 350 μl de tampão MACS, 50 µ l de reagente de bloqueio de FcR e 100 μl de Pan células dendríticas biotina-anticorpo Cocktail a 4° C por 10 minutos. Nota: O anticorpo cocktail contra antígenos que não são expressas por DCs.</li>
		<li>Lave as células pela adição de 9 ml de tampão de MACS e centrifugar a 300 x g por 5 minutos.</li>
		<li>Ressuspender as células em 800 μl de tampão de MACS e adicionar 200 μl de antigrânulos biotina a 4 ° C por 10 minutos.</li>
		<li>Repita as etapas de 3.1.9-3.1.11 para coletar DCs.</li>
		<li>Lavar a coluna com outro 3 ml de tampão de MACS duas vezes e também coletar o escoamento.</li>
		<li>Tratar a 2 x 105 DCs/ml na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA a 37 ° C para 1 hr separadamente, rótulo o CD4+ T células (1 x 107/ml) com 1 μM CFSE a 37 ° C por 15 minutos, lave com PBS e reajustar o volume para obter a concentração final de 2 x 106 T células/ml.</li>
		<li>Em seguida, em uma placa de 96 poços, co cultura 100 μl de células dendríticas tratadas com o mesmo volume de CD4 CFSE-rotulado+ T cells, ambos colhidos os passos acima para obter 01:10 proporção. Agora adicione 100 ng/mL ovalbumina (OVA) peptídeo 323-329 por bem e medir a intensidade CFSE das células T por citometria de fluxo após 2-3 dias de incubação. Nota: O número de células e a relação de DCs e T células foram otimizadas de nossa anterior trabalho37.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induzir o passivo EAE injetando BMDCs pulsada com mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG) (35-55)
	<ol>
<li>Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por bem em 6-placa com meio de cultura na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA para incubar 1 hr.</li>
		<li>Adicionar 10 ng/ml de LPS para incubação 24 hrs.</li>
		<li>Adicionar 100 μg/ml de MOG (35-55) para incubação 4 hrs.</li>
		<li>A suspensão de células e centrifugar 300 x g por 5 min. da colheita.</li>
		<li>Ressuspender as células com PBS e contar as células.</li>
		<li>Por via subcutânea injete 200 μl de 2 x 106 células de camundongos C57BL/6 fêmeas de 8-10 semanas de idade (100 μl em cada pata traseira).</li>
		<li>No dia da injeção de BMDC e 48 hrs. mais tarde, injetar 200 ng de toxina pertussis (PTX) em cada rato.</li>
		<li>Repita etapas 3.2.6-3.2.7 uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas.</li>
		<li>Avalie os sintomas clínicos da EAE diariamente usando critérios padrão37 (0.5-manco cauda final, cauda 1-manco, fraqueza do membro posterior de 2-moderado, 3-grave membro posterior fraqueza, paralisia dos membros posteriores de 4-completo, estado 5-quadriplegia ou moribundo, morte-6).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Este artigo descreve um protocolo eficiente que pode ser usado para reproducibly para gerar CIDS e posteriormente diferenciá-los em TolDCs, e propomos que isto pode ser aplicado para avaliar a capacidade de novos agentes de alvo molecular para induzir a TolDC fenótipo. Conforme descrito neste relatório, seguimos uma sequência em que primeiro foram analisados TolDC expressão de ligantes de superfície por citometria de fluxo, seguida por uma avaliação do perfil de citocinas do DC medido por qRT-PCR e ELISA. Finalmente, a função de imunorreguladores de TolDCs foi confirmada, demonstrando a sua capacidade de reduzir a célula T proliferação em vitro e sua eficácia para suprimir a auto-imunidade em in vivo, utilizando o modelo EAE pré-clínicos murino de MS.
Em nosso protocolo, iDCs foram gerados e diferenciadas de precursores de murino da medula óssea com a combinação de GM-CSF e IL-4. Outros protocolos usaram ligantes de formulários, como tirosina quinase 3 (Flt3L) em meio de cultura para gerar iDCs44. Embora o uso de Flt3L aumenta o rendimento de iDCs, estes CIDS geralmente levam 2 mais dias (9) a colheita, em comparação com GM-CSF/IL-4 adição (7 dias)44. Mais importante, iDC gerado a partir de Flt3L muitas vezes diferenciar em ambos os conjuntos (CD8– e CD8+) e pDCs45 que eram funcionalmente e fenotipicamente equivalentes ao estado estacionário DCs in vivo. No entanto, GM-CSF/IL-4 invariavelmente induz a diferenciação da iDC para conjuntos (CD8–) apenas44 e durante a maturação, eles demonstraram caracteres similares de inflamatória DCs46. Vale ressaltar que saiba que o GM-CSF/IL-4 geralmente é usada em ensaios clínicos e de pesquisa básica por causa da vantagem de diferenciar o DCs de monócitos ou CD34+ progenitores44. Ficou demonstrado que iDCs gerados a partir desses dois métodos produzem células morfologicamente diferentes, que também possuem marcadores de superfície celular diferentes e apresentam perfis distintos de citocina após sua ativação. Além disso, TolDCs induzidas por esses métodos variam em sua capacidade de migrar em resposta a Fatores Quimiotáticos e induzir a célula de T antígeno-específicos respostas44,45. Nós entendemos que CD8+ DCs podem apresentar mais potencial na indução de TolDC devido à sua capacidade única de cross-tolerance47. No entanto, então é necessário mais celular classificação de BMDCs derivado de Flt3L para investigar o CD8 específicas+ DC subconjunto. Além disso, desde então, GM-CSF/IL-4 induzida BMDCs são superiores na estimulação de células T e a produção de mediadores inflamatórios seguindo LPS tratamento44,45, encontramos esta estratégia deu resultados mais reprodutíveis nosso experimentos.
BMDCs derivados de GM-CSF/IL-4 início de expressar CD11c dia 4 e para enriquecer a expressão após dia 648. Este procedimento de cultura pode ser sustentado até dia 10-12 com uma menor densidade de chapeamento de células da medula óssea e uma baixa dose de GMC-SF no dia 8-1049. Neste protocolo, CDDO-DFPA (triterpenoides sintético) e LPS foram adicionados em tandem, como agentes para induzir tolerância DC e maturação, respectivamente. Recentemente, informou que os iDCs colhidas das culturas utilizando este método de geração de BMDC apresentam um fenótipo de TolDC funcional quando pré-tratados com CDDO-DFPA37. Vale ressaltar que o CDDO-DFPA, que só foi adicionado à culturas após colheita de iDC (dia 7)37, em contraste com agentes como vitamina D3, que deve ser adicionado à culturas várias vezes durante a iDC diferenciação (dia 2, 4, 6)50. Além disso, esta indução de TolDCs pela vitamina D3 pode depender de diversos mecanismos que devem ser iniciados durante e após a diferenciação de iDC51. Nossos dados sugerem que adicionar CDDO-DFPA durante a diferenciação do iDC não teve impacto sobre a pureza de CD11c + DCs dose-dependente diminuir o rendimento de iDCs no dia 7 (dados não mostrados). Nossas análises também sugerem que a maior concentração de CDDO-DFPA usado nesses experimentos pode ser tóxica para as células progenitoras de medula óssea, mesmo que o iDC mostrou viabilidade normal com esta concentração de CDDO-DFPA37. Prevê-se que a indução de TolDC pode ser otimizada por análises cuidadosas do impacto do tempo e duração da exposição a agentes como o CDDO-DFPA.
É importante considerar os métodos alternativos e os mecanismos através dos quais CIDS podem ser induzido a mDCs pelos outros do que de LPS, como CD40L, TNF-α e IFN-γ52. Maturação de DC por LPS através de receptores Toll-like 4(TLR4) leva a ativação de diversos fatores de transcrição, incluindo o fator nuclear-κB (NF-κB), p38 mitogen-ativado proteína quinase (p38 MAPK), c-Jun N-terminal kinase (JNK) e extracelular sinal-regulado de proteína quinase (ERK1/2). A maturação dos DCs por CD40L e TNF-α através de receptores CD40 e TNF induz respectivamente da via do NF-κB. Em contraste, IFN-γ estimula um caminho diferente, incluindo a ativação da quinase de Janus (JAK), tirosina quinase (TYK) e o transdutor de sinal e ativador de proteínas de transcrição (STATs), e estes efeitos a jusante também são complementados por ativação do NF-κB via52. Além disso, enquanto o perfil de expressão de gene de maturação CD40L TNF-α-base/DC sugere que esses DCs polarizar as células T em direção a uma célula de Th2 resposta53, maturação DC por IFN-γ é fortemente inclinada para um de resposta Th1 célula54. Portanto, esses outros indutores de maturação DC, que estão ligadas à diferenciação na direção de subconjuntos de célula T específica não são empregados no presente protocolo.
Vários relatórios têm demonstrado que ex vivo-DCs diferenciadas são capazes de induzir o espectro completo de sintomas clínicos de EAE e patologia em ratos55. O método de indução de EAE passiva por ex vivo ativado DCs tem sido adotado com várias modificações por diferentes laboratórios. A combinação de indução de EAE passiva e ativa pela administração de MOG preparado BMDCs, 7 dias antes da imunização com MOG e completa adjutor de Freund (CFA) resulta em maiores escores de sintomas clínicos (escore clínico de pico: 3.5) em comparação com a EAE passiva indução pela administração do MOG aprontado BMDCs sozinhos (escore clínico de pico: 2)56. Resultados com este método combinando MOG aprontado BMDCs com MOG imunização sugere o início da doença acontece no dia 9, após a imunização com MOG e CFA56. No entanto, uma vez que é sabido que o CFA provoca inflamação significativa no local de administração57, nós utilizaram passiva indução EAE pela administração de DCs sozinhos em nosso protocolo a fim de efetivamente analisar o efeito da TolDCs durante a EAE. A fim de confirmar ainda mais o fenótipo funcional de TolDCs, um deve também testá-los em suprimir os sintomas clínicos de ratos EAE ativos. A via de administração de DCs é também fundamental para a indução de sintomas EAE58. Conforme relatado pelo nosso laboratório e por outros, injeção subcutânea de BMDCs para a região de flanco de camundongos C57BL/6 uma vez por semana para um total de 3-4 injeções induz uma pontuação clínica pico da EAE em torno de 2-2.5 com o aparecimento da doença podem ser reproduzidos no dia 11-1237 ,58. Nós fornecemos um pequeno clip para demonstrar os diferentes sintomas clínicos entre ativo e passivo indução de EAE (vídeo 1).
As reconhecidas limitações do nosso protocolo incluem o tempo necessário pelos métodos utilizados e a dependência de um microambiente não-fisiologicamente relevante para a diferenciação de BMDC. No entanto, quando o anticorpo enriquecido métodos de separação da coluna de coleção para DCs e células T de murino baço podem ser mais eficiente uma vez, sofre um baixo rendimento da população DC desejado. Assim, a vantagem do método de desenvolvimento de DC derivadas da medula óssea é o rendimento mais elevado da escala log das populações DC quando comparado à separação de coluna anticorpo do baço inteiro. Conforme observado acima, as DCs geradas em vitro por esse método requer uma alta concentração de suplementação de citocinas, que não é fisiologicamente relevante para DCs na vivo microambiente59 e também não garante a longo prazo sustentabilidade da DC. O GM-CSF usado em nosso protocolo também não é uma citocina essencial para normal DC diferenciação na vivo60. No entanto, o protocolo de geração de BMDC proposto reproducibly produz uma alta fração de funcionalmente TolDCs e deve ser visto como um método altamente confiável e reprodutível para gerar DCs funcionais com propriedades tolerogenic.
Em conclusão, o TolDCs gerado a partir do protocolo descrito aqui pode ser efetivamente caracterizado avaliando seus perfis de expressão de gene e proteína, determinando a sua capacidade de modular a célula T-dependente respostas imunes em vitroe avaliar sua função como uma terapia celular adotiva para suprimir EAE indução na vivo. Nosso protocolo fornece uma estrutura para a avaliação de quaisquer novos agentes pensado para ter a capacidade de induzir TolDCs e ainda mais, acelerar o processo de desenvolvimento terapêutico para TolDCs do banco, a clínica.

Células dendríticas (DCs) são parte integrante do sistema imune inato e primeiro foram descobertas e caracterizadas por Ralph Steinman e Zanvil Cohn em 1973 como principal antígeno profissional apresentando células1. DCs foram mostrados a desempenhar um papel importante na ativação imune, apresentando transformados de antígenos de células T e células B através de complexos de histocompatibilidade (MHC) em órgãos linfoides secundários de ligação a sistemas de imune inata e adaptativa2. No sistema imunológico dos mamíferos, existem pelo menos duas categorias de DCs, que tem sido descritos como mieloide DCs e plasmocitoide DCs (pDCs)3. DCs mieloides, também conhecidos como DCs convencionais (conjuntos), caracterizam-se pela expressão de CD11c e podem ser diferenciados como imaturo DCs (CIDS) em vitro de células progenitoras de medula óssea ou monócitos do sangue periférico utilizando Granulócito-macrófago-colônia-estimulando factor (GM-CSF) e IL-4 na espécie humana ou murino, respectivamente4.
Ativar o 'perigo' sinais, tais como padrões moleculares associados patógeno (PAMP) ou padrões moleculares associados a danos (DAMP), irá conduzir iDCs maturação em direção a DCs imunogênicas como maduros DCs (mDCs) através da ligação de vários receptores de reconhecimento padrão a superfície de DC5. Imunogênicas DCs mais prime ingênuo T proliferação e diferenciação celular através da regulação alta de MHCII2ligantes co-estimulação (CD80, CD86 e CD40)6, citocinas e outros mediadores solúveis7. Uma cascata de produção pro-inflamatórios mediador de DCs imunogênica é essencial para a diferenciação de pilha de T mediada por citocinas. Por exemplo, tanto o IFN-γ e IL-12 são necessários para a diferenciação de células Th18 e Il-1, IL-6 e IL-23 são críticos para ingênuo células T polarização no sentido de células Th179. Embora maduros DCs reagem aos antígenos estranhos, ativação descontrolada de DC por autoantígenos pode causar ablação de tolerância e fomentar o desenvolvimento de doenças autoimunes, gerando células auto-reativas T, cuja ativação leva à destruição de tecido10 .
Relatórios recentes forneceram evidência clara de plasticidade DC, exemplificada pela sua capacidade de interagir com diferentes pistas dentro de seu microambiente de tecido e de se diferenciar em subconjuntos distintos efetor/supressor DC. Os mediadores anti-inflamatórios, tais como IL-10,11e TGF-β12HO-113 foram mostrados a desempenhar um papel importante na supressão imune através da indução de tolerogenic DCs (TolDCs). Estes TolDCs adquirir funções reguladoras e suprimir a proliferação de células T14. Além disso, a falta de estimulação co pela DCs e a produção de mediadores anti-inflamatórios da TolDCs tanto contribuem para a indução de células T reguladoras (Tregs) e também efetivamente inibir tanto Th1 e Th17 diferenciação e expansão15. Nas últimas duas décadas, o potencial terapêutico de TolDCs foi relatado por diversos investigadores. Nesses estudos, a administração da ex-vivo gerado TolDCs não só melhorada sintomas patológicos em diferentes modelos pré-clínicos de doenças auto-imunes16 mas também levou ao desenvolvimento de tolerância imunológica em pacientes17 ,18. Curiosamente, hoje a terapia de TolDCs tem sido considerada como uma abordagem alternativa ou adjuvante para doenças auto-imunes em vários ensaios clínicos, incluindo o tipo 1 diabetes mellitus19, artrite reumatoide20, 21, esclerose múltipla (MS)22,23,24e doença de Crohn25.
Há uma variedade de protocolos que têm sido empregadas para desenvolver TolDCs e vários laboratórios relataram métodos para geração e Caracterização fenotípica de TolDCs. Estes métodos podem ser usados para gerar reproducibly TolDCs em vitro de progenitores hematopoiéticos e estàvel, mantê-los em um tolerogenic estado na vivo26,,,27,2829. Os iDCs pode ser convertida em TolDCs pela exposição a vários agentes farmacológicos imunomoduladores ou citocinas anti-inflamatórias. Por exemplo, a vitamina D3 é um conhecido agente farmacológico conhecido para aumentar a produção de IL-10 e suprimir a secreção de IL-12 de DCs e, assim, aumentar sua função imunossupressora30. Além disso, quando DCs são expostos a estímulos inflamatórios potentes, tais como lipopolissacarídeos (LPS), vários agentes farmacológicos tais como dexametasona31, rapamicina32e corticosteroides33 foram mostrados para induzir a TolDC fenótipo, reduzindo a expressão de superfície DC de CD40, CD80, CD86 e MHCII34. IL-10 e TGF-β são as citocinas anti-inflamatórias mais estudado para induzir DC tolerância35 e a exposição concomitante a ambos dessas citocinas têm sido mostradas para induzir um fenótipo tolerogenic em DCs36.
Desde o tolerogenic que DC é definido pelas características funcionais, ao invés de por marcadores fenotípicos, há um grande precisa desenvolver um método consistente para a caracterização funcional e celular de TolDCs. Além disso, um protocolo rigoroso e consistente deve ser estabelecido para a avaliação consistente e caracterização do fenótipo tolerogenic DC se estamos efetivamente e reproducibly comparar a capacidade de novos agentes para induzir o fenótipo TolDC na laboratório. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado com métodos passo a passo para isolar CIDS de progenitores hematopoiéticos de ratos e posteriormente analisar a eficácia de novos agentes sob avaliação pela sua capacidade de converter iDCs em TolDCs, fornecendo um robusto Caracterização fenotípica e funcional de TolDCs tanto in vitro e in vivo. Esta descrição inclui um método elaborado para caracterizar a TolDCs por seus ligantes de superfície, perfil de citocinas e imunossupressoras funções em vitro. Nós também fornecemos um exemplo de um método para explorar a potencial aplicação terapêutica destes TolDCs em um modelo pré-clínico de MS, encefalomielite auto-imune experimental (EAE). Este protocolo estabelecido ajudará os investigadores para avaliar a capacidade de novos agentes para promover a indução de TolDCs e irá facilitar o esforço para ampliar o escopo do desenvolvimento terapêutico de TolDC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td>
			<td>Reata Pharmaceuticals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse GM-CSF</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>315-03</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-4</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>214-14</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>L2880</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>516732</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin (PTX)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3097</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG (35&#8211;55) peptide</td>
			<td>21stCentury Biochemicals</td>
			<td>in house synthesis</td>
			<td>EAE induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 plus L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD80</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557227</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated CD86</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555665</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated PD-L1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>124307</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated MHCII</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-112-388</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated CD11c</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340544</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched PE</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-835</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotype matched APC</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-091-836</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423801</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan dendritic cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-100-875</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell isolation kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-104-454</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309626</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309588</td>
			<td>BMDC differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>A2058</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filter</td>
			<td>Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase D</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>11088858001</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025076</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin (OVA) peptide 323&#8211;329</td>
			<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
			<td>O1641</td>
			<td>T cell proliferation assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IFN-&#947; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01168134_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00434165</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY419-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse EDN-1 ELISA</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>ELM-EDN1-1</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00443258</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse TNF-&#945; Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MTA00B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm00446190</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>M6000B</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-23a TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01160011</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-23 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DY1887-05</td>
			<td>ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm99999154_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10 TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01288386_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946; TaqMan probe</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Mm01178820_m1</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Heme Oxygenase 1 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13248</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8226</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Inc.</td>
			<td></td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and functional characterization of murine tolerogenic dendritic cells

O sistema imunológico funciona através da manutenção de um equilíbrio apertado entre as respostas coordenação contra antígenos estranhos e manter um estado sem resposta contra autoantígenos, bem como antígenos derivados de organismos comensais. O rompimento da homeostase imune pode levar à inflamação crônica e para o desenvolvimento de auto-imunidade. Células dendríticas (DCs) são as células apresentadoras profissionais do sistema imunológico inato envolvida na ativação de células T de ingênuo para iniciar respostas imunes contra antígenos estranhos. No entanto, a DCs também podem ser diferenciados em TolDCs que agem para manter e promover a tolerância de células T e a suprimir as células efetoras, contribuindo para o desenvolvimento das condições de qualquer inflamação auto-imune ou crônica. O recente avanço em nossa compreensão de TolDCs sugere que a tolerância de DC pode ser alcançada, modulando suas condições de diferenciação. Este fenômeno tem levado ao crescimento tremendo no desenvolvimento de terapias TolDC por numerosos distúrbios imunológicos causados devido a quebrar em tolerância imunológica. Estudos bem sucedidos em murino modelos pré-clínicos auto-imunidade ainda mais tem validado o utilitário imunoterapia de TolDCs no tratamento de doenças auto-imunes. Hoje, TolDCs tornaram-se uma ferramenta promissora e imunoterapia na clínica para reintegrar tolerância imunológica em várias desordens imunes ao direcionar respostas auto-imunes patogénicas deixando intacta a imunidade protetora. Embora vários laboratórios para induzir TolDCs propôs uma matriz de estratégias, não há nenhuma consistência em caracterizar o fenótipo celular e funcional dessas células. Este protocolo fornece um guia passo a passo para o desenvolvimento da DCs derivadas da medula óssea em grandes números, um método exclusivo usado para diferenciá-los em TolDCs com um sintético triterpenoides 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic ácido-diflúor-propil-Amida (CDDO-DFPA) e as técnicas utilizadas para confirmar o seu fenótipo, incluindo análises de assinaturas moleculares essenciais de TolDCs. Finalmente, mostramos um método para avaliar a função TolDC testando sua resposta imunossupressoras em vitro e em vivo em um modelo pré-clínicos de esclerose múltipla.

A diferenciação e seleção de BMDCs:
Células progenitoras de medula óssea foram cultivadas em meio RPMI completo na presença de GM-CSF e IL-4, de se diferenciarem em iDCs para 7 dias (figura 1A). No dia 1, as células eram pequenas em tamanho e mostraram a morfologia esférica. Lavagem com PBS antes da substituição de meio fresco no dia 3 ajudou células para clusters de forma e também aumentou a população de CD11c+ células. No dia 4, BMDCs foram ampliadas em tamanho e iniciou a formação de cluster. Aderidas macrófagos também foram convertidos e observados na parte inferior da placa com uma forma alongada. No dia 5, formam-se grandes aglomerados tamanhos de BMDCs. No dia 6, um grande número de BMDCs flutuantes e semi aderentes também foram observado. BMDCs foram colhidas no dia 7 e analisadas por citometria de fluxo para CD11c expressão como um marcador específico de murino DCs. Como mostrado em uma trama de citometria de fluxo representativo na figura 1B, cerca, 83,6% dos BMDCs expressando CD11c foram obtidos por esse método.
Indução e caracterização genética de TolDCs:
Alguns dos agentes conhecidos por induzir TolDCs, tais como a vitamina D338 e dexametasona39, são conhecidos por para baixo-regula a expressão de ligantes de superfície DC, incluindo MHC II e moléculas de co-estimulação CD40, CD80 e CD86. Por outro lado, no contexto de LPS ou ou induzida por CD40L maturação de DCs, inibidores de calcineurina ciclosporina A e FK506 não mostraram nenhum efeito sobre a expressão de CD83, CD80, CD86 e MHC II33. Como demonstrado pela análise de citometria de fluxo, a indução de TolDC por CDDO-DFPA não teve nenhum efeito significativo na expressão de DCs, incluindo CD80, CD86, MHC II, PD-L1 e CD40 ligante superfície induzida por LPS. (Figura 2).
Além disso, a análise comparativa de transcriptoma e citocinas de BMDCs tratados com ou sem CDDO-DFPA na presença ou ausência de LPS retratado o perfil do gene inflamatória modulada. Tratamento de CDDO-DFPA reduziu significativamente LPS induzida por citocinas pró-inflamatórias genes como IFN-γ, IL-12, EDN1, TNFa, IL-6 e IL-23 (Figura 3A-3F). Estes são conhecidos citocinas para Th1 (IFN-γ e IL-12) e Th17 (IL-6 e IL-23) diferenciação de células. Além disso, o CDDO-DFPA tratamento BMDCs mostrou a maior expressão de genes de citocinas anti-inflamatórias, tais como IL-4, IL-10, TGF-β e HO-1 (Figura 4A-4D). Estes genes anti-inflamatórios são conhecidos modulador de auto-imunidade, promovendo Th2 (IL-4) e a diferenciação de células Treg (IL-10 e TGF-β). 40 aqui é importante notar que o distintivo de IL-12−; de produção de citocinas IL-10+ 36, a indução da expressão de HO-113e a inibição da EDN-141 induzida pelo tratamento CDDO-DFPA, são todos conhecido para autenticar DCs tolerogenic função.
Caracterização funcional e celular de TolDCs em vitro
Proliferação celular de T mediada por DC é conhecida por ser desencadeada pelo noivado de co-estimulação ligante de superfície, bem como a secreção de citocinas e mediadores solúveis7. No entanto, TolDCs inibir respostas de células T através de vários mecanismos: através da indução de células T anergy, promovendo ativamente a exclusão de células auto-reativas e promovendo a polarização de ingênuo T células Tregs42. Já informamos a caracterização funcional de CDDO-DFPA induzida por TolDCs37. Anergy de células t e exclusão de células auto-reativas T podem ser analisados independentemente pela verificação de marcadores de superfície ou coloração anexina V/7-AAD. No entanto, confirmamos indiretamente este fenótipo medindo o índice de proliferação de células T. Por isso, nós utilizados ratos transgénicos OTII C57BL/6 células T e expô-los a DCs syngeneic extraído de camundongos C57BL/6 e tratados com ou sem CDDO-DFPA. Esses DCs foram lavados e co cultivadas com CFSE manchada de células T com um peptídeo de óvulos. Observou-se uma redução significativa na proliferação de células T por DCs pré-tratados CDDO-DFPA, sugerindo seu fenótipo tolerogenic (Figura 5).
Na vivo caracterização funcional de TolDCs em um modelo pré-clínicos de auto-imunidade
Finalmente, a funcionalidade de TolDCs induzida por DFPA pode ser testada em qualquer um de um número de pré-clínicos em vivo modelos caracterizadas auto-imunes ou inflamatórias características. Desde então, EAE é um modelo murino pré-clínicos amplamente aceitado da doença do sistema nervoso central clínica imune-mediada, MS43, isto utilizamos em nosso estudo atual. A fim de continuar a analisar o na vivo funcionalidade de CDDO-DFPA induzida TolDCs, nós desafiou-os em um modelo murino pré-clínicos da EAE passiva. Por isso, BMDCs foram cultivados com ou sem CDDO-DFPA na presença de LPS e MOG (35-55). Essas células foram então injetadas repetidamente como protocolo regular representado na figura 6A e ratos observaram-se rotineiramente para a manifestação dos sinais clínicos. Como esperado, LPS e MOG (35-55) pulsada BMDCs mostrou sintomas clínicos da EAE, entretanto; CDDO-DFPA aprontado BMDCs tratados grupo mostrou início retardado de doença com sintomas clínicos significativamente reduzidas (Figura 6B). Esses resultados validam o fenótipo imunossupressora de TolDCs induzida por tratamento CDDO-DFPA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig1.jpg"> Figura 1: desenvolvimento e Caracterização fenotípica de BMDCs: (A) células da medula óssea foram expelidas de ossos tíbia e fêmur de camundongos C57BL/6 e ainda mais diferenciadas para BMDCs. Uma formação de aglomerado de célula apropriada foi rastreada pela microscopia de luz durante todo o período de diferenciação (escala bares, 100µm). (B) a diferenciação de BMDCs foi confirmada pela expressão superfície CD11c, como analisado por FACS. Gráficos retratam o percentual do CD11c expandido+ população da pilha. (C) Gating estratégia de células BMDCs. foram primeiro condomínio fechado para excluir os restos (FSC vs CCD). Um portão de exclusão dubleto foi utilizado para portão em camisolas células (FL2-W vs. FL2-A). Dentro das células singlet, células vivas foram bloqueadas na trama AAD-7 (7-AAD vs FSC). Então as células ainda mais foram analisadas e fechadas na expressão CD11c. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig2.jpg"> Figura 2: DC célula superfície ligante expressão é inalterada por CDDO-DFPA. As células foram previamente tratadas na presença ou ausência de CDDO-DFPA (200 nM) por 1 hora antes da estimulação com LPS (100 ng/ml) por 24 hrs. Superfície de célula de expressão de CD80, CD86, MHC II, PD-L1 e CD40 foi analisada por citometria de fluxo. Esta figura foi modificada em Relatórios científicos 7, número de artigo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduzido e republicada com permissão de direitos autorais. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig3.jpg"> Figura 3: CDDO-DFPA alterou o fenótipo genético e proteína de imunogênicas DCs. BMDCs pre-foram tratados na presença ou ausência de CDDO-DFPA (50-400 nM) por 1 hora antes da adição de LPS (100 ng/ml), e também colhido para extração do RNA (4 hrs.) ou permitiu a condição de meio de cultura para 24 hrs. antes da coleta para análises de citocina. Os níveis de IL-12 (B), TNFa (D), IL-6 (E) e IL-23 (F) foram medidos por qRT-PCR e ELISA. Considerando que o nível de IFN-γ (A) foi medido por qRT-PCR e EDN-1 (C) por ELISA sozinha. Os resultados são expressos em média ± D.P. de três experimentos. * P < 0.05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001 em comparação com os grupos tratados com LPS. Teste-t de student não pareado. Esta figura foi modificada em Relatórios científicos 7, número de artigo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduzido e republicado com a permissão dos direitos autorais." <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig4.jpg"> Figura 4: CDDO-DFPA induzido fenótipo TolDCs confirmado pela expressão de gene e proteína. BMDCs foram previamente tratadas na presença ou ausência de CDDO-DFPA (10-400 nM) por 1 hora antes da adição de LPS (100 ng/ml), e as células foram colhidas para a extração de RNA após 24 hrs. Os níveis de IL-4 (A), IL-10 (B) e TGF-β (C) foram medidos por qRT-PCR. (D) célula proteína lisados foram coletados em 12 hrs. para as análises e os níveis de HO-1 e β-actina expressão era determinada pela mancha ocidental. Os resultados são expressos em média ± D.P. de três experimentos. * P < 0.05, * * P < 0,01, * * * P < 0,001 em comparação com os grupos tratados com LPS. Teste-t de student não pareado. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig5.jpg"> Figura 5: CDDO-DFPA expostos DCs suprimir a proliferação de células T. DCs foram pré-tratados com CDDO-DFPA (100-400 nM) por 1 hora apenas e, em seguida, lavado e co culta com CFSE manchadas de células T em um 01:10 proporção. (A) esplênica de células T e DCs foram isoladas de ratos transgénicos C57BL/6 OTII e camundongos C57BL/6, respectivamente. CDDO-DFPA DCs pré-tratados co foram cultivados com CFSE manchadas de células T com (com) ou sem (w/o) adição de óvulos durante a incubação. Proliferação de células t foi determinada pela citometria de fluxo no dia 2. Gráficos retratam o percentual da divisão de células T em relação ao números de divisão de células T. Os dados são uma representação de 3 experimentos independentes. Esta figura foi modificada em Relatórios científicos 7, número de artigo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduzido e republicada com permissão de direitos autorais. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57637/57637fig6.jpg"> Figura 6: MOG aprontado passiva induzida por DC EAE é revogada por TolDCs. (A) indução EAE por MOG (35-55)-pulsada BMDCs. BMDCs maduros foram tratados na presença ou ausência de CDDO-DFPA (400 nM) e posteriormente pulsado com MOG (35-55) por 4 horas. Um total de 200 μl de 2 × 106 células foi administrado por via subcutânea em região de flanco de camundongos C57BL/6 uma vez cada semana durante um total de quatro injeções. Cada vez, PTX foi administrado por injeção i.p. imediatamente e novamente 2 dias depois (dia 0 no 4º ciclo). (B) clínicos foram gravadas afinal quatro injeções, usando critérios padrão. Todos os dados foram apresentados como a média ± no MEV mostrou * P < 0,05. Vários testes t com análise Holm-Sidak (n = 7 ratos em cada grupo). Esta figura foi modificada em Relatórios científicos 7, número de artigo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduzido e republicada com permissão de direitos autorais. <a href="/files/ftp_upload/57637/57637fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

development-functional-characterization-murine-tolerogenic-dendritic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K visualizações.  Case Western Reserve University. Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Vídeo: Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

Segmentação e medição de volumes de gordura em modelos de obesidade em roedores usando raios-X Tomografia Computadorizada

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Medicina

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and standardized not only for the study of allo-rejection but also between syngeneic strains for examining mechanisms of ischemia-reperfusion injury after lung transplantation. Although the application of the rat and other large animal model 2 contributed significantly to the elucidation of these studies, the scope of those investigations is limited by the scarcity of knockout and transgenic rats. Due to no effective therapies for obliterative bronchiolitis, the leading cause of death in lung transplant patients, there has been an intensive search for pre-clinical models that replicate obliterative bronchiolitis. The tracheal allograft model is the most widely used and may reproduce some of the histopathologic features of obliterative bronchiolitis 3. However, the lack of an intact vasculature with no connection to the recipient's conducting airways, and incomplete pathologic features of obliterative bronchiolitis limit the utility of this model 4. Unlike transplantation of other solid organs, vascularized mouse lung transplants have only recently been reported by Okazaki and colleagues for the first time in 2007 5. Applying the basic principles of the rat lung transplant, our lab initiated the obliterative bronchiolitis model using minor histoincompatible antigen murine orthotopic single-left lung transplants which allows the further study of obliterative bronchiolitis immunopathogenesis6.

Obliterative bronchiolitis is the key impediment to the long-term survival of lung transplant recipients and the lack of a robust preclinical model precludes examining obliterative bronchiolitis immunopathogenesis. Unlike other solid organ transplants, vascularized mouse lung transplantation has only recently been developed. Here we show our independently developed obliterative bronchiolitis model after murine orthotopic single-lung transplantation.

Desenvolvimento de bronquiolite obliterante em um modelo murino de transplante de pulmão ortotópico

Orthotopic lung transplantation in rats was first reported by Asimacopoulos and colleagues in 1971 1. Currently, this method is well accepted and ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Avaliação do cancro do ovário esferóide Apego e invasão de células mesoteliais em Tempo real

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput caracterização de células-tronco adultas modificadas para liberação de fatores terapêuticos como estratégia de neuroproteção

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

In vitro caracterização funcional de Rato Colorretal Aferente Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

preparação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...